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研究目的1.探讨重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24增殖的影响。2.探讨重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24凋亡的影响。3.探讨细胞线粒体凋亡途径中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对膀胱癌细胞株抑制增殖和促进凋亡作用的机制。4.探讨重楼皂苷Ⅱ对荷人膀胱癌Balb/c裸鼠皮下移植瘤的影响。研究方法1.检测重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24细胞增殖的抑制作：采用MTT(噻唑蓝)比色法,以丝裂霉素C(mitomycin C, MMC)作为阳性对照,检测重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ在不同浓度下,作用24h、48h和72h时对EJ、BIU-87、T24细胞生长的抑制作用,并测定其半数抑制浓度(IC50)。流式细胞术检测重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ作用于膀胱癌细胞EJ、BIU-87、T24后,引起的肿瘤细胞周期的变化。分析重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对不同膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24抑制作用的差异,分析三株人膀胱癌细胞分别对重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ反应的异同。2.检测重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24细胞凋亡的影响：电镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ作用于膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24细胞后,细胞的超微亚结构的影响；流式细胞术检测重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24细胞凋亡的影响。3.重楼皂苷Ⅰ/Ⅱ对膀胱癌细胞凋亡机制的初步研究：为探讨重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ引起膀胱癌细胞凋亡的机理,我们选择了细胞线粒体凋亡途径进行进一步研究,提取实验组和对照组总RNA,逆转录为cDNA,并用real-time PCR定量分析扩增了cytochrome c,Bcl-2,Bax,caspase-3,caspase-9基因,用western blot方法探讨了cytochrome c, Bcl-2, Bax, caspase-3, caspase-9蛋白的表达情况。4.重楼皂苷Ⅱ对荷人膀胱癌Balb/c裸鼠的治疗评价：建立荷人膀胱癌Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,从体内实验去验证重楼皂苷Ⅱ对人膀胱癌的有效性。实验结果1.重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对膀胱癌细胞株EJ, BIU-87、T24细胞的增殖有抑制作用：重楼皂苷Ⅰ浓度低于1μg/ml时,即使延长药物作用的时间,其对EJ、BIU-87、T24细胞的增殖的抑制作用没有显著差异(P>0.05)；重楼皂苷Ⅰ浓度在高于1μg/ml时,重楼皂苷Ⅰ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24细胞的增殖有抑制作用(P<0.05),并表现出明显的时间依赖性和浓度依赖性；重楼皂苷Ⅰ对EJ细胞作用24h、48h、72h时的IC50值分别为：8.099,4.931,3.933μg/ml;重楼皂苷Ⅰ对BIU-87细胞作用24h、48h、72h时的IC50值分别为：8.229,5.048,3.999μg/ml;重楼皂苷Ⅰ对T24细胞作用24h、48h、72h时的IC50值分别为:8.751,5.297,4.012μg/ml。重楼皂苷Ⅰ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24细胞增殖的抑制作用的没有明显差异(P>0.05)。重楼皂苷Ⅱ浓度在高于1μg/ml后,重楼皂苷Ⅱ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24细胞的增殖有抑制作用,并表现出明显的时间和浓度依赖性。重楼皂苷Ⅱ对膀胱肿瘤细胞EJ、BIU-87、T24作用24h、48h、72h时的IC50值分别为：重楼皂苷Ⅱ对EJ细胞作用24h、48h、72h时的IC50值分别为：8.271,5.457,3.815μg/ml;重楼皂苷Ⅱ对BIU-87细胞作用24h、48h、72h时的IC50值分别为：8.133,5.387,3.636μg/ml;重楼皂苷Ⅱ对T24细胞作用24h、48h、72h时的IC50值分别为：8.529,5.761,3.905μg/ml。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24细胞增殖的抑制作用的没有明显差异(p>0.05)。重楼皂苷Ⅰ(浓度分别为1,2,4 and 8μg/ml)作用于膀胱癌细胞后,流式细胞仪检测,见到细胞周期不同程度阻滞于G2/M期。重楼皂苷Ⅱ则引起细胞周期不同程度阻滞于S期。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24细胞增殖的抑制作用的未见明显差异(p>0.05)；三株细胞对重楼皂苷Ⅰ的反应未见显著差异,对重楼皂苷Ⅱ的反应亦未见显著差异。2.重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对膀胱癌细胞株EJ/BIU-87/T24细胞凋亡的影响：我们用浓度为为4μg/ml的重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ的作用于膀胱癌细胞,留取24h和48h时的细胞在电镜下观察见到：未使用药物干预时,细胞表面有丰富的微绒毛,细胞浆内见多量线粒体,粗面内质网结构完整、连续,核糖体均匀分布,细胞核内染色质清晰,核仁明显,核膜清楚,细胞浆染色均匀,细胞间隙清晰,可见幼稚连接。重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ作用于膀胱癌细胞后24h见到部分细胞体积缩小,微绒毛减少或消失,细胞浆内出现空泡,部分区域胞浆浓缩,部分线粒体肿胀,少数内质网扩张,溶酶体增多,细胞核膜皱缩,染色质成块状,有的细胞核碎裂、溶解,呈现出凋亡的现象。重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ作用48h时电镜观察见到细胞形态不一致,细胞膜皱缩,部分结构不完整、模糊；细胞浆水肿变性,线粒体肿胀,数目减少,细胞器数量减少,溶酶体增多；核染色质呈块状边集于核膜,部分核碎裂、溶解,可见出泡现象及凋亡小体形成现象。重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ(浓度为1,2,4 and 8μg/ml)作用于膀胱癌细胞,12h,24h和48h时用流式细胞仪检测,观察重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ作用时间时膀胱癌细胞的凋亡率。随着重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ浓度的增加和作用时间的延长,凋亡比率逐渐增加,呈现出时间和剂量依赖性。3.重楼皂苷Ⅰ/Ⅱ对膀胱癌细胞凋亡机制的初步研究：通过对cytochrome c, Bcl-2,caspase-3,caspase-9和Bax基因的克隆,发现重楼皂苷Ⅰ作用于人膀胱癌细胞后,可见Bax、Bcl-2、caspase-9扩增减少,cytochromec扩增增加,caspase-3扩增亦有增加。Western blot见到cytochrome c,caspase-3表达增高,Bax变化不明显,Bcl-2, caspase-9蛋白的表达减低。重楼皂苷Ⅱ组进行实时定量PCR扩增以后见到Bcl-2扩增减少明显,cytochrome c扩增增加,caspase-3、caspase-9扩增亦有增加,Bax复制变化不明显。Western blot检测到cytochrome c,caspase-3, caspase-9表达增高,Bcl-2蛋白表达减低,Bax蛋白的表达略有增加。4.重楼皂苷Ⅱ对荷人膀胱癌Balb/c裸鼠的治疗评价：对照组皮下移植瘤生长迅速,30天时肿瘤直径已达17mm左右,重楼皂苷Ⅱ在用药后2周期间,皮下移植瘤的生长减慢,肿瘤体积缓慢增大,用药2周后,肿瘤体积开始缩小,但是没见完全消失,实验动物精神好,未见明显消瘦。生存率曲线可见MMC治疗组及重楼皂苷Ⅱ治疗组明显高于对照组,未治疗组生存中位数时间为33天,平均生存天数33.7天；MMC治疗组的生存中位数时间为44天,平均生存天数50.3天；重楼皂苷Ⅱ治疗组的生存中位数为47天,平均生存天数48.7天。结论1.重楼皂苷Ⅰ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24细胞的增殖有明显的抑制作用,EJ、BIU-87、T24三株膀胱癌细胞对重楼皂苷Ⅰ的反应没有差异。其作用机理可能与重楼皂苷Ⅰ引起膀胱癌细胞的细胞周期阻滞于G2/M期,诱发膀胱癌细胞凋亡而发挥作用,呈现出时间和剂量依赖性。2.重楼皂苷Ⅱ对膀胱癌细胞株EJ、BIU-87、T24细胞的增殖有明显抑制作用,EJ、BIU-87、T24三株膀胱癌细胞对重楼皂苷Ⅱ的反应没有差异。其作用机理可能与重楼皂苷Ⅱ引起膀胱癌细胞的细胞周期阻滞于S期,诱发膀胱癌细胞凋亡而发挥作用,呈现出时间和剂量依赖性。3.重楼皂苷Ⅰ组作用于人膀胱癌细胞后,可见Bax、Bcl-2、caspase-9扩增减少,cytochrome c扩增增加,caspase-3扩增亦有增加。Western blot见到cytochrome c,caspase-3表达增高,Bax变化不明显,Bcl-2, caspase-9蛋白的表达减低。重楼皂苷Ⅱ组作用于人膀胱癌细胞后Bcl-2扩增减少明显,cytochrome c扩增增加,caspase-3、caspase-9扩增亦有增加,Bax复制变化不明显。Western blot检测到cytochrome c,caspase-3, caspase-9表达增高,Bcl-2蛋白表达减低,Bax蛋白的表达略有增加。重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ不仅影响凋亡相关基因的复制,另外也可能通过影响凋亡相关蛋白的表达的环节而发挥抗膀胱癌的作用。4.重楼皂苷Ⅱ在体内也有抑制膀胱癌细胞增殖的作用,能抑制肿瘤的生长,延长生存时间,用药期间裸鼠耐受良好。5.重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ可能成为膀胱癌病人术后灌注治疗的备选药物之一。