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奶牛乳房炎通常就是指乳腺发生了炎症,是由多种因素引起严重程度不同的复杂疾病。最后会由于环境、病原体以及宿主的不同而导致不同的后果,因此治疗代价较高且不容易治愈。当致病菌进入到无菌环境,常常会破坏一些物理屏障如乳头而引起乳房炎,这就需要及时和适当的宿主防御来防止细菌的滋生避免炎症的加剧。另一方面,这些传染性病原体如金黄色葡萄球菌和链球菌很容易从感染牛的一个乳区蔓延到其它乳区或者是其它的牛。像年龄、泌乳阶段和体细胞评分这些因素都会影响牛感染乳房炎的几率。不同的病原体会引起不同的乳房炎从而导致乳腺组织产生不同的免疫反应,因此宿主需要根据病原体的情况来产生相应的应答从而保护机体免受感染。本试验以中国荷斯坦奶牛的乳腺组织和乳腺上皮细胞为研究对象,研究了炎症信号通路的作用机制。通过组织学观察正常和乳房炎乳腺组织的结构差异,采用基因芯片的方法分析了 TLR4/NF-κB炎症信号通路在正常与乳房炎乳腺组织中的基因表达情况;利用体外培养的方法,研究了化学抑制和siRNA抑制NF-κB基因对乳腺上皮细胞中TLR4/NF-κB信号通路关键基因表达的影响;运用蛋白质组iTRAQ技术,筛选激活和抑制p65条件下乳腺上皮细胞中的差异蛋白。1.荷斯坦奶牛正常与乳房炎乳腺组织的基因表达谱芯片分析宿主感染乳房炎后会引起Toll样受体4介导的核转录因子κB信号通路的激活,从而促进了炎症相关基因的表达和先天免疫反应。在本试验中,运用基因芯片技术和生物信息学分析了正常与感染乳房炎乳腺组织中的全部基因表达水平的情况。在这些基因中对参与TLR4/ NF-κB信号通路的基因进行分析发现,共产生48个差异表达的基因,与正常组织相比较,其中有19个基因在感染乳房炎乳腺组织中表达上调,有29个基因表达下调。同时挑选了主要的10个基因CD14、TNF-α、MD-2、IL-1β、NF-κB、IL-12、TLR4、MyD88、IL-6和IL-10进行了荧光定量PCR验证,挑选了 4个基因进行Western-blot验证,结果显示与正常乳腺组织相比较TLR4、MyD88、IL-6和IL-10在患乳房炎乳腺组织中表达上调,CD14、TNF-α、MD-2、IL-1β、NF-κB和IL-12表达下调,与芯片结果一致。对这些差异表达的基因,利用生物信息学数据库资源如GO和KEGG进行分析,发现这些基因调控着与免疫功能相关的不同通路。2.化学干涉抑制NF-κB基因对TLR4/NF-κB信号通路表达的影响研究表明,脂多糖是革兰氏阴性菌外膜的主要组成成分,在炎症反应的诱导中起着关健的作用。LPS信号主要通过TLR4激活NF-κB从而诱导炎性介质的产生。本试验利用乳腺上皮细胞体外培养的方法,研究NF-κB基因的特异性化学抑制剂bay11-7082对乳腺细胞内TLR4/NF-κB信号通路关键基因表达的影响。试验采用常用的组织块接种法,得到纯度较高的乳腺上皮细胞,随后进行LPS处理细胞建立炎症模型和NF-κB基因抑制实验。结果表明LPS能够激活TLR4/ NF-κB信号通路。通路上的一些基因如 TLR4、NF-κB、MyD88、IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA水平表达增加以及TLR4、NF-κB、IL-1β和TNF-α的蛋白含量增加。Bay11-7082处理细胞后,NF-κB的表达显著下降,对LPS诱导的乳腺上皮细胞IL-1β和TNF-α的释放减少,炎症信号通路上的基因如TLR4、MyD88和IL-6的表达都有一定程度的降低。3.基因干涉NF-κB基因表达对乳腺上皮细胞炎症通路相关基因的影响为了使试验设计更加严谨,试验结果具有可重复性,除了化学抑制NF-κB基因还通过基因干涉来沉默NF-κB基因,从而观察对乳腺上皮细胞TLR4/ NF-κB信号通路相关基因的影响。在得到纯度较高的牛乳腺上皮细胞后,进行NF-κB基因干扰试验。结果表明,NF-κB-siRNA处理细胞后抑制了 NF-κB基因从细胞质到细胞核的移位。同时促炎症因子TNF-α和IL-1β的表达明显下降。TLR4/NF-KB信号通路上的一些主要基因如TLR4、NF-κB、MyD88和IL-6的表达明显下降而CD14、IL10和MD-2的表达却显著增加。结果与化学抑制试验相一致。4.激活和抑制p65条件下乳腺上皮细胞差异蛋白质的筛选除了在基因水平观察NF-κB基因对炎症通路的影响,更从蛋白的水平来筛选激活和抑制前后的差异蛋白质。在本试验中,分别将乳腺上皮细胞进行3组处理:不作任何处理的乳腺上皮细胞;用LPS处理的乳腺上皮细胞;用LPS和bay11-7082处理的乳腺上皮细胞,运用相对和绝对定量技术和液相色谱法识别不同的调节蛋白。将LPS组与不作处理组相比较获得差异表达的蛋白,将加入LPS和bay11-7082组与LPS组进行比较获得相应的差异蛋白。共筛选出17个蛋白,其中有8个蛋白在LPS组表达显著下调,在bay11-7082组表达却显著上调,有9个蛋白在LPS组表达显著上调,在bay11-7082组表达显著下调。P65蛋白与LPS vs空白组中差异蛋白质的互作关系网络图,途中共有225个点,形成两两相互作用关系有717个,p65蛋白与bay11-7082 vs LPS中差异蛋白质的相互作用关系网络图,图中共有56个点,形成的两两互作关系有77个。综上所述,得出以下结论:1.在正常与乳房炎乳腺组织中筛选出了参与TLR4/NF-κB信号通路的48个差异表达的基因,这些基因还分别参与了 TOLL样受体信号通路、MAPK信号通路以及细胞凋亡等过程,结果表明乳腺组织在细菌的感染后会通过TLR4/NF-κB通路释放细胞因子和趋化因子。2.在LPS诱导的炎症模型中,激活了 TLR4/NF-κB信号通路,上调了炎症因子的表达,致细胞损伤,通过化学抑制和siRNA干扰两种抑制方法沉默NF-κB,均下调了炎症因子的表达,并影响炎症信号通路上相关基因的表达。3.在抑制和激活条件下,蛋白芯片共筛选出17个差异表达蛋白,在P65蛋白与LPS vs空白组中差异蛋白质的互作关系网络图中,筛选出了与p65蛋白连接度和压力向心性较高的13个基因;在p65蛋白与bay11-7082 vsLPS中差异蛋白质的相互作用关系网络图中,筛选出了与p65蛋白连接度和压力向心性较高的9个基因。