肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤,且大部分患者均为晚期肺癌,治疗效果差,病死率高。随着目前新的治疗方案的应用,肺癌患者的整体生存期有了明显的提高,但是晚期肺癌患者5年生存率仍较低,仍需要寻求新的治疗方案来进一步提升晚期肺癌患者的生存期。多年前Folkman提出一种观点,即肿瘤生长需要新生血管的形成,因此抑制新生血管生成成为治疗肿瘤的一项重要手段,抗血管生成治疗便成为了治疗晚期肺癌患者的研究领域的热点,并不断有新的抗血管生成分子靶向药物出现,其疗效与安全性在临床上也得到肯定。目前抗血管靶向治疗成为治疗晚期肺癌的一种新的治疗手段。贝伐单抗是用于晚期非小细胞肺癌治疗的第一种抗血管治疗药物,它通过与VEGF竞争性的结合VEGFR,而VEGF是促进血管生成的最主要刺激因子,阻断VEGF/VEGFR的信号传导途径后,VEGF无法发挥其作用,从而有效抑制新生血管的生成。但是贝伐单抗不能单药治疗肺癌,研究发现贝伐单抗联合部分化疗方案可以在一定程度上提高单纯化疗对晚期非小细胞肺癌患者的总体生存期。阿帕替尼是我国自主研发的新型的抗肿瘤血管生成药物,是一种可以口服的小分子酪氨酸激酶抑制剂,通过选择性地抑制VEGFR-2的酪氨酸激酶活性,阻断信号通路传到,从而有效抑制肿瘤新生血管生成,减少肿瘤血供,抑制肿瘤的生长。目前阿帕替尼主要用于晚期胃癌的治疗,包括肺癌在内的其他肿瘤研究相对较少,缺少阿帕替尼治疗晚期肺癌患者的随机临床对照研究,临床证据尚不充分。并且阿帕替尼对肺癌细胞及裸鼠移植瘤的基础研究较少,对阿帕替尼治疗的优势人群、阿帕替尼联合化疗及靶向药物治疗能否提高晚期肺癌患者的疗效以及采取哪种联合方式能取得最佳治疗效果不明确,本研究围绕着上述几个问题进行研究,主要包括以下三部分的内容。第一部分阿帕替尼促进细胞凋亡与诱导细胞周期阻滞抑制不同肺癌细胞增殖的体外体内研究研究目的:观察阿帕替尼对五种肺癌细胞的体外和体内增殖的抑制作用。目前尚不明确阿帕替尼是否对肺癌细胞体外有抑制作用,对不同类型的肺癌细胞的抑制作用强弱是否不同,探索阿帕替尼治疗肺癌的潜在优势人群,并探讨阿帕替尼抑制肺癌细胞增殖的机制。研究内容及方法:CCK-8法及单克隆试验测定阿帕替尼对不同肺癌细胞体外增殖的抑制作用,并计算其ICs0值;Western blot与qPCR分别检测五种肺癌细胞系的VEGFR-2蛋白及基因的表达水平,进而选择出低表达VEGFR2的A549细胞与高表达VEGFR2的H1975与H446细胞为代表进行下一步实验。流式细胞仪检测阿帕替尼对不同肺癌细胞周期的影响;Tunel及流式细胞仪测定阿帕替尼对三种细胞凋亡的影响,Western blot检测三种细胞中c-Caspase-3、PARP凋亡机制相关蛋白表达水平,并利用细胞免疫荧光技术测定c-Caspase3表达,进一步验证凋亡机制。建立三种肺癌细胞的移植瘤模型,分别给予不同剂量阿帕替尼进行干预,观察不同剂量阿帕替尼对裸鼠移植瘤生长抑制作用,免疫组化观察CD31、Ki-67、c-caspase3表达情况;测量裸鼠的体重,同时生化法测定血清ALT/AST、BUnN/Cr、LDH-L/CK及GLU水平,ELISA法测定FT3/FT4的浓度,并观察心、肝、肾、甲状腺、胰腺的病理结构变化,观察阿帕替尼的副作用。同时Western blot及免疫荧光检测H1975与H446细胞应用阿帕替尼后LC3-Ⅱ的表达情况,CCK8法测定阿帕替尼联合氯喹后对种两种高表达VEGFR2肺癌细胞的IC50值的变化,并构建两种肺癌细胞的裸鼠移植瘤模型,观察阿帕替尼联合氯喹后,能否增加阿帕替尼对裸鼠移植瘤的抑制作用。研究结果:阿帕替尼对高表达VEGFR2的H1975和H446两种肺癌细胞增殖的抑制作用明显强于其他三种细胞,其IC50值明显低于其他三种肺癌细胞。随着浓度的升高,H1975和H446细胞形成的集落数明显减少(P<0.05);阿帕替尼主要将细胞阻滞在G2期,较对照组有显著统计学差异(P<0.05);Tunel和流式细胞检测凋亡显示随着阿帕替尼浓度升高,凋亡细胞比例明显升高,较对照组有统计学差异(P<0.05),c-caspase3及c-PARP表达均明显增高(P<0.05),在低表达VEGFR2的A549细胞中应用阿帕替尼并没有上述变化。对于H1975和H446细胞构建的裸鼠移植瘤模型,随着阿帕替尼给药剂量增加,对于移植瘤生长的抑制作用更加明显,均较对照组有显著统计学差异(P<0.05),CD31、Ki67表达较对照组明显减少,c-caspase3表达明显升高,均有显著统计学差异(P<0.05);而在A549细胞构建的裸鼠移植瘤模型中,高剂量组阿帕替尼才能看到对移植瘤有明显的抑制作用,而低剂量的阿帕替尼组移植瘤的体积对比对照组并没有明显的统计学差异(P>0.05)。各组裸鼠体重均有不同程度增加,各组之间无统计学差异(P>0.05);血清ALT/AST、BUN/Cr、LDH-L/CK水平无显著统计学差异(P>0.05),高剂量组裸鼠血糖、FT3、FT4水平明显降低,较对照组有显著统计学差异(P<0.05);心肝肾等脏器HE染色显示,应用阿帕替尼后尚无明显病理结构改变,但电镜下观察其超微结构发现应用阿帕替尼后组织细胞的线粒体、内质网等超微结构有不同程度的损伤,且有一定的剂量相关性。在体外及体内应用阿帕替尼后,均可以使H1975和H446细胞自噬表达蛋白LC3-Ⅱ表达增高,联合自噬抑制剂后可降低阿帕替尼对高表达VEGFR2的两种肺癌细胞的IC50值;阿帕替尼联合氯喹后,其裸鼠移植瘤的体积明显小于阿帕替尼单药组。研究结论:对高表达VEGFR-2的H1975和H446肺癌细胞,阿帕替尼可以有效抑制其增殖,并有一定的剂量相关性,通过Caspase3/PARP途径诱导其发生凋亡;可以有效抑制裸鼠移植瘤的生长,减少移植瘤组织中微血管密度。药物对其他脏器的副作用主要是超微结构的损伤,对甲状腺和胰腺损伤更为显著,血清相关指标有一定程度变化。阿帕替尼可以诱导高表达VEGFR2的H1975和H446肺癌细胞自噬增加,自噬增加可以在一定程度上诱导两种肺癌细胞对阿帕替尼耐药,联合自噬抑制剂后,可以提高阿帕替尼对H1975和H446细胞移植瘤的抑制作用。第二部分阿帕替尼联合化疗及靶向治疗对非小细胞肺癌的体内外抑制作用研究研究目的:阿帕替尼是一种特异性的作用于VEGFR-2的小分子酪氨酸激酶抑制剂,在多种恶性肿瘤中显示了良好的治疗效果,但单药治疗耐药快,总体有效率有限。在本研究中,我们探讨了体内外阿帕替尼联合化疗及靶向药物对三种非小细胞肺癌的抑制作用不同与机制,观察抗血管生成药物阿帕替尼与化疗或靶向治疗药物联合应用,能否有效提高化疗或靶向药物单药的治疗效果,并初步探讨其作用机制,并观察联合用药的安全性。研究内容及方法:在体外,采用CCK8试剂盒检测阿帕替尼对3种人非小细胞肺癌细胞(EGFR基因野生型A549细胞、E746-A750缺失型HCC827、L858R和T790M双突变型H1975)增殖的影响。分别检测阿帕替尼单药以及分别联合培美曲塞、埃克替尼、奥希替尼后3种肺癌细胞的体外抑制作用,并计算联合阿帕替尼后对3种肺癌细胞的IC50值,计算协同指数,阿帕替尼与化疗药物和靶向药物之间有无协同抑制作用。通过构建3种肺癌细胞的裸鼠移植瘤模型进行验证阿帕替尼对不同肺癌细胞的体内抑制作用,每种细胞的移植瘤模型均分为4组(对照组,阿帕替尼或培美曲塞、埃克替尼、奥希替尼单药组,阿帕替尼联合其他药物治疗组),均分别干预治疗21天,绘制移植瘤生长曲线,观察阿帕替尼联合化疗及靶向药物能否提高其抑瘤效果。免疫组化染色观察各组移植瘤组织中MVD和Ki67的表达,观察不同干预措施对肿瘤组织中微血管密度和增殖的影响。Western blot测定各组移植瘤组织中相关信号通路蛋白AKT、mTOR、ERK的磷酸化水平。观察各组裸鼠的体重,并通过制作病理切片,应用HE和免疫组化染色观察裸鼠的心、脑、肝、肾等脏器的病理结构和MVD的变化,初步探讨阿帕替尼联合化疗及靶向药物治疗的安全性。研究结果:阿帕替尼对3种肺癌细胞的体外增殖的抑制作用均随其药物浓度的增加而增强,其中阿帕替尼对H1975肺癌细胞增殖的抑制作用最强,阿帕替尼体外对3种肺癌细胞的IC50值分别为44.59±3.95μM,39.88±3.77μM,16.49±1.48μM,对比有显著统计学差异(P<0.05)。联合用药组比相同浓度的单药组对肺癌细胞的增殖抑制作用更强。在A549细胞,阿帕替尼联合培美曲塞的协同指数为CI=0.61±0.07,在HCC827细胞,阿帕替尼联合埃克替尼CI=0.53±0.05,在H1975细胞,阿帕替尼联合奥希替尼的协同指数CI=0.60±0.05,三种细胞均有协同作用。与对照组相比,阿帕替尼、化疗及靶向药物单药均对裸鼠移植瘤的增长有一定的抑制作用,阿帕替尼联合其他药物治疗组对移植瘤的抑制作用最明显。联合组移植瘤组织中MVD、Ki67蛋白的表达水平明显降低,较其他组有明显统计学差异(P<0.05);联合组移植瘤组织中信号通路相关蛋白AKT、mTOR、ERK的磷酸化表达水平明显下降,较其他组有显著的统计学差异(P<0.05)。在上述三种肺癌裸鼠移植瘤中,以对H1975细胞株构建的裸鼠移植瘤的增殖抑制作用最强。各组裸鼠体重对比无显著统计学差异,心、脑、肝、肾组织HE病理学无异常,心、脑微血管密度各组间无显著性差异。阿帕替尼单药及联合用药组较其他组别肝、肾微血管密度显著减少,但阿帕替尼联合组与阿帕替尼单药组相比,裸鼠的肝、肾组织中MVD无显著性差异。研究结论:阿帕替尼单药对三种非小细胞肺癌细胞的体外增殖均有一定的抑制作用,以对H1975肺癌细胞株的增殖抑制最为明显。阿帕替尼联合化疗及靶向药物后,可以有效提高其对肺癌细胞的抑制作用,明显降低其对三种肺癌细胞的1IC50值,有明显的协同抑制作用。阿帕替尼联合化疗及靶向药物可以明显提高对三种裸鼠移植瘤的抑制作用,联合治疗可以有效降低移植瘤组织中MVD表达,降低增殖活性,显著降低相关信号蛋白的磷酸化水平。阿帕替尼联合化疗及靶向药物治疗安全性高,不增加毒副反应。第三部分阿帕替尼诱导血管正常化并序贯化疗对裸鼠移植瘤及肺癌患者的作用研究研究目的:新生血管在肿瘤的发生、生长、增殖、侵袭和转移中,起到非常重要的作用。在肿瘤血管系统中,新生血管结构紊乱,形态异常,血管壁结构不完整,导致血管壁渗漏,组织间液压力升高,血流阻力升高。这些改变导致局部微环境的改变,主要表现为缺氧和酸中毒,进一步影响化疗药物的疗效,导致化疗药物效果不佳。一些抗血管生成药物不但可以抑制肿瘤新生血管生长,还可以使异常的肿瘤血管达到正常化,血管正常化后可以更有效地将氧气和药物运输到肿瘤细胞中,提高化疗及靶向药物的疗效。阿帕替尼是一种特异性的VEGFR2抑制剂,可以抑制肿瘤血管的生成,从而有效控制肿瘤的生长。但是阿帕替尼能否诱导肿瘤组织中血管正常化尚不明确,且阿帕替尼诱导血管正常化的时间和剂量也不明确,因此有必要进行阿帕替尼诱导血管正常化的研究,确定诱导血管正常化的剂量和时间,同时观察阿帕替尼诱导血管正常化后序贯全身化疗对肺癌细胞裸鼠移植瘤及患者的效果,进一步优化抗血管生成药物联合化疗的给药策略,提高联合治疗的疗效,延长肺癌患者的总体生存期。研究内容及方法:我们选择人非小细胞肺癌细胞A549(EGFR野生型)进行研究,体外培养细胞,然后构建其裸鼠移植瘤模型,选取60只荷瘤裸鼠进行血管正常化研究,分别给予生理盐水,阿帕替尼60mg/kg和120mg/kg灌胃进行干预。连续干预治疗10天。分别在给药前和给药后的第1、第3、第7和第10天时间点上,各处死四只裸鼠。免疫组化染色检测每组移植瘤组织在不同时间点的HIF-1α,α-SMA,college-ⅣV的表达,western blot检测移植瘤组织中MMP-2和MMP-9蛋白的的表达水平,并通过电镜观察每组移植瘤组织中肿瘤血管的超微结构,综合上述指标确定阿帕替尼诱导移植瘤血管正常化的剂量和时间。在明确阿帕替尼诱导移植瘤血管正常化时间窗的所需的剂量和时间后,将32只荷瘤裸鼠随机分为四组,分别为对照组,培美曲塞单药组,阿帕替尼联合培美曲塞同步治疗组,阿帕替尼序贯培美曲塞治疗组。其中序贯治疗组是指应用一定剂量和时间的阿帕替后,诱导移植瘤组织中肿瘤血管处于正常化,然后在血管正常化期间以相同剂量给予培美曲塞腹腔注射,其中血管正常化需要的阿帕替尼的具体剂量和时间由第一步试验结果得出数据。四组裸鼠连续干预14天,测量瘤体体积,绘制抑瘤曲线。免疫组化染色测定移植瘤组织MVD,ki67和c-caspase3的表达水平,western blot相关信号通路蛋白的表达水平。同时选则符合条件的20例晚期非小细胞肺癌患者,应用阿帕替尼序贯全身化疗治疗,初步观察其临床疗效及安全性。研究结果低剂量组使用阿帕替尼治疗后,在治疗的第3天和第7天HIF-1α明显降低,α-SMA和Ⅳ型胶原水平明显升高;两组之间有统计学差异(P<0.05)。但是,在大剂量阿帕替尼组中,各时间点各组之间的HIF-1α,α-SMA和Ⅳ胶原表达没有显著差异(P>0.05);与其他剂量和时间组相比,在低剂量阿帕替尼治疗后的3-7天期间,移植的肿瘤组织中MMP-2和MMP-9的表达水平显著降(P<0.05),在其他时间或高剂量组中,表达水平没有显著变化(P>0.05);低剂量阿帕替尼治疗的第3天和第7天,移植的肿瘤组织中的血管结构完整且规则,观察到周细胞结构,血管基底膜结构完整,未观察到明显的间隙。然而在其他时间点和大剂量组中,移植瘤组织中血管结构仍然紊乱,未观察到成熟的周细胞结构,且血管基底膜不完整。从抑瘤曲线上看,与对照组相比,其余三组均有明显的抑瘤作用。肿瘤体积较对照组存在显著统计学差异,并且低剂量阿帕替尼和培美曲塞的序贯治疗可产生最佳抑制效果,也显著优于阿帕替尼同步培美曲塞治疗组。每组裸鼠的体重对比没有显著差异。阿帕替尼序贯培美曲塞组移植瘤组织中Ki67表达明显降低,而caspase3的表达显著升高,与其他三组相比有显著差异(P<0.05)。序贯治疗组移植肿瘤组织中p-AKT,p-mTOR,p-MEK和p-ERK的表达水平明显低于其他组(P<0.05)。阿帕替尼序贯全身化疗治疗的20例晚期非小细胞肺癌晚期患者治疗效果如下:CR(n=0),PR(n=3),SD(n=14)和PD(n=3)。ORR和DCR分别为 15.0%和85.0%。PFS的中位数为4.85个月,OS的中位数为10.2个月。患者发生3/4级毒性率为25%。在任何患者中均未观察到4/4级毒性。研究结论:低剂量的阿帕替尼应用3-7天可以在一定程度上诱导移植瘤组织肿瘤血管达到正常化,在这个时间窗内联合化疗可以有效提高化疗药物的抑瘤效果,临床治疗效果上看,小剂量的阿帕替尼序贯全身化疗治疗晚期非小细胞肺癌患者有一定疗效,可以在一定程度上延长患者的总体生存期,且安全性较高。