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研究背景与目的:慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronic liver failure,ACLF)是在慢性肝病基础上,由急性因素如感染等诱发的一类肝衰竭综合征,其与急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)均表现为肝功能的急剧恶化,并伴随多器官功能衰竭及高病死率。过度的全身性炎症是ALF与ACLF的共同显著特征,单核细胞则是二者发病、进展及恢复的主要固有免疫细胞之一。前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)作用于前列腺素E受体发挥广泛调节机体免疫反应的作用,其中前列腺素E受体2(Prostaglandin E Receptor 2,EP2)被报道与肝硬化失代偿患者巨噬细胞功能低下密切相关。酒精性ACLF或急性肝硬化失代偿患者外周血单核细胞和由它分化而来的巨噬细胞表现出免疫抑制的特征,然而慢性乙型肝炎相关的慢加急性肝衰竭(chronic hepatitis B related ACLF,HB-ACLF)患者各免疫细胞的免疫状态尚不清楚,PGE2/EP2在ACLF患者中的作用,以及PGE2对D-GalN/LPS诱导的ALF作用及其作用机制亦尚无报道。本课题旨在研究ACLF患者体内各免疫细胞的表型功能改变,及PGE2和其受体EP2对各免疫细胞的调控作用,并且利用小鼠D-GalN/LPS诱导ALF模型探索16,16-二甲基前列腺素E2(16,16-dimethyl PGE2,dmPGE2)对ALF的缓解作用及其调控单核细胞凋亡的机制,从而进一步理解ACLF的免疫学发病机制,并为寻求ACLF和ALF新治疗方法提供理论依据。第一部分:研究PGE2及其受体EP2对HB-ACLF患者外周血免疫细胞的作用目的:明确HB-ACLF患者外周血免疫细胞的免疫状态及PGE2/EP2对这些免疫细胞的作用。方法:收集135例HB-ACLF患者,128例慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者,180例健康对照者(Healthy control,HC)的外周血样本。ELISA法检测血浆PGE2、液相芯片技术检测血浆27种细胞因子的产生及用流式细胞术检测各免疫细胞EP2表达、抗感染免疫相关分子TLR4等、自发性活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和LPS或大肠杆菌刺激后ROS及细胞因子的产生。进一步流式检测EP2+免疫细胞特征,将EP2表达与血浆细胞因子水平或病情评分做相关性分析,并给予MIP-1β和IP-10观察EP2表达变化。最后阻断或激动EP2,检测细菌吞噬作用和ROS产生的变化,液相芯片技术检测细胞上清27种细胞因子的产生。结果:(1)与HC相比,ACLF单核细胞和中性粒细胞TLR4上调;与HC和CHB相比,HB-ACLF单核细胞和中性粒细胞自发性ROS产生和大肠杆菌或PMA刺激的ROS产生增加,HB-ACLF的PBMC对LPS刺激分泌更多的细胞因子。(2)与HC和CHB相比,HB-ACLF患者血浆PGE2水平增加,外周血各免疫细胞EP2表达异常,尤其在CD8+T细胞上明显下调。EP2+单核细胞或中性粒细胞比EP2-的单核或中性粒细胞表达更多的TLR4、TLR2、CD11b及HLA-DR及对大肠杆菌刺激产生更多ROS。此外,EP2+PBMC比EP2-的PBMC对LPS 应答分泌更多IL-10 和 IFN-y。(3)HB-ACLF患者30天无移植存活组血浆PGE2水平高于移植或死亡组(p<0.05),90天随访期内并发多器官功能衰竭的患者CD8+T细胞上EP2表达较无并发多器官功能衰竭的患者低(p<0.05)。下调的CD8+T细胞上EP2表达与血浆细胞因子 MIP-1β(r=-0.66,p=0.024)、IP-10(r=-0.67,p=0.028)水平和病情评分 MELD(r=-0.41,p=0.017)、CLIF-C(r=-0.48,p=0.004)负相关。(4)MIP-1β和IP-10联合能下调CD8+T细胞上EP2表达(p<0.05)。(5)体外阻断EP2能增强HB-ACLF患者PBMC的IL-6、TNF-α和MCP-1等细胞因子分泌、ROS产生,但减弱吞噬作用。激动EP2能减少HB-ACLF患者PBMC的IL-2、TNF-α、MIP-1 β和FGF-basic等细胞因子产生,但增加G-CSF产生。结论:(1)HB-ACLF患者的外周血PBMC和中性粒细胞对LPS或大肠杆菌刺激表现出超敏反应,下调的EP2表达与患者病情和对LPS或大肠杆菌的超敏反应有关。(2)选择性激动EP2能抑制HB-ACLF患者PBMC对LPS或大肠杆菌的超敏反应并增加细胞因子G-CSF的产生,为HB-ACLF治疗提供新靶标奠定理论基础。第二部分:研究dmPGE2对D-GalN/LPS诱导的小鼠ALF的缓解作用及对单核细胞凋亡的调控及其机制目的:明确PGE2类似物16,16-dimethyl PGE2(dmPGE2)对D-氨基半乳糖胺/脂多糖(D-galactosamine/Lipopolysaccharide,D-GalN/LPS)诱导的 ALF 的缓解作用,及调控单核细胞凋亡的作用及其机制。方法:体内实验采用D-GalN/LPS腹腔注射建立急性肝衰竭小鼠模型,设生理盐水对照组、D-GalN/LPS诱导模型组和dmPGE2治疗组或PGE2合成酶阻断剂组,观察小鼠的肝脏炎症、血清转氨酶、血清细胞因子及外周血中单核细胞的自噬和凋亡情况。进一步联合自噬抑制剂,观察肝脏及全身炎症和单核细胞的凋亡的变化。体外实验采用PGE2和EP2拮抗剂处理单核细胞系U937检测自噬水平。结果:(1)dmPGE2能显著降低D-GalN/LPS诱导的ALF小鼠的血清转氨酶,改善肝内炎症,并能降低血清细胞因子。(2)dmPGE2诱导ALF小鼠单核细胞凋亡。(3)PGE2-EP2通路在体内外能促进单核细胞的自噬。(4)联用自噬阻断剂后,ALF小鼠血清细胞因子、转氨酶再度增加及肝内炎症重新加重,单核细胞凋亡水平也重新降低。结论:dmPGE2能缓解D-GalN/LPS诱导的ALF,其机制可能是通过促进单核细胞自噬依赖性的凋亡,PGE2通路可能是ALF治疗的潜在新靶标。