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研究背景结肠腺癌是人体常见的恶性肿瘤之一,近年来,结肠腺癌的发病率逐年上升。随着治疗方法的发展,结肠腺癌的预后有了很大的提高,但仍有部分患者不可避免地出现复发和转移。目前在对肿瘤复发和转移的研究中发现肿瘤干细胞发挥着重要的作用。ASPM是一种异常纺锤体样小头畸形相关基因,主要功能是调节细胞的有丝分裂,被认为是一项干细胞的标记物。ASPM在多种肿瘤中均表达上调,并与肿瘤的进展和预后密切相关。此外,有研究证实在胰腺癌和前列腺癌中,ASPM通过Wnt/β-catenin信号通路参与了肿瘤的发生发展。在结肠腺癌中90%以上病例均由于Wnt信号通路的异常激活引起,推测ASPM在结肠腺癌中可能与Wnt信号通路存在关联。目前,ASPM在结肠腺癌中的表达意义及其作用机制的研究鲜有报道。我们前期预实验发现ASPM在结肠腺癌中的表达要高于正常肠黏膜组织,因此我们推断ASPM也可能通过Wnt/β-catenin信号通路参与了结肠腺癌的发生发展。目的1.通过免疫组化和RNAscope技术分析ASPM在结肠腺癌组织中的表达及与临床病理参数的关系,并通过免疫组化检测错配修复蛋白PMS2、MLH1、MSH6和MSH2在结肠腺癌中的表达,评估ASPM与MSI的相关性。2.在体外细胞实验中,检测ASPM对结肠癌细胞的增殖、侵袭和凋亡的影响。3.分析ASPM与经典Wnt信号通路的相关因子FZD、DVL、β-catenin、c-myc和CyclinD1的关系。方法1.选取解放军总医院病理科经病理证实为结肠腺癌,并同时伴发结肠腺瘤的手术切除标本99例和相对应的99例癌旁正常肠黏膜组织作为研究对象,采用免疫组织化学方法分析ASPM、β-catenin、PMS2、MLH1、MSH6、MSH2、c-myc和CyclinD1 在结肠腺癌、腺瘤及正常肠黏膜组织中的表达情况;分析ASPM与结肠腺癌临床病理参数之间的关系;分析ASPM与β-catenin、c-myc、CyclinD1以及错配修复蛋白MLH1、MSH6、MSH2和PMS2之间的相关性。2.另选取20例结肠腺癌原发灶和结肠腺癌肝转移灶组织,通过RNAscope方法检测在结肠腺癌原发灶和肝转移灶中ASPM mRNA的表达差异。3.在结肠癌细胞株中采用瞬时转染技术(siRNA)将ASPM基因沉默,分别观察转染前后结肠癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的改变。4.采用qRT-PCR和Westemblot方法检测转染前后结肠癌细胞中ASPM与FZD、DVL、β-catenin,c-myc和CyclinD1相关性,并通过挽救实验进一步分析ASPM与Wnt信号通路的关系。结果:1.ASPM在结肠腺癌中的表达与TNM分期和淋巴结转移呈明显正相关(P<0.05)。结肠腺癌原发灶中ASPM mRNA的表达量明显低于其在肝转移灶中的表达(P<0.05)。在结肠腺癌中,ASPM的表达分别与β-catenin、c-myc和CyclinD1呈显著正相关(P<0.05)。结肠腺癌中ASPM的表达与MSI的发生不具有相关性(P>0.05)。2.在结肠癌细胞中,将ASPM基因沉默后,结肠癌细胞的增殖能力减低,凋亡率升高,同时结肠癌细胞的侵袭能力明显下降。3.沉默结肠癌细胞中的ASPM后,结肠癌细胞中经典Wnt信号通路相关蛋白β-catenin及下游效应分子c-myc和CyclinD1的表达均明显下调(P<0.05)。通过Wnt言号通路激活剂的作用,可以挽救由于ASPM基因沉默而导致的β-catenin、c-myc和CyclinD1表达水平的降低(P<0.05)。结论1.ASPM与结肠腺癌的TNM分期和淋巴结转移密切相关,推测其可能是判断结肠腺癌侵袭和转移的一项指标。2.ASPM可以促进结肠癌细胞的增殖和侵袭,降低结肠癌细胞的凋亡能力。3.ASPM可能通过Wnt-FZD-DVL-β-catenin信号通路参与了结肠腺癌的发生发展。