背景:骨髓间充质干细胞（bone-derived mesenchymal stem cells、MSCs）因为拥有很强的成骨能力,并且获取容易,可以自体取材,而成为骨组织工程最理想的种子细胞。然而,目前国内外普遍取用的培养自体人MSCs的方法,存在细胞生长缓慢,培养周期长等不足,很大程度限制了MSCs在临床治疗上的应用。因此改进MSCs的培养方法,实现hMSC在体外快速扩增,是非常必要的。 目的:利用造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）的条件培养基培养兔MSCs（rMSCs）,同时在相同的培养条件下,采用全骨髓法和密度梯度离心法培养rMSCs,比较三种方法培养的rMSCs在细胞生长,干细胞纯度以及成骨能力方面是否存在差别,以探讨HSCs环境对MSCs的影响。 方法:从成年兔髂骨、胫骨分离全骨髓细胞,等分为全骨髓组、密度离心组和条件培养基组,分别采用全骨髓法和密度梯度离心法,于含15%胎牛血清的高糖型DMEM培养基,在37℃,5%CO₂条件下培养全骨髓组和密度离心组rMSCs。收集HSCs条件培养基,用条件培养基培养自体rMSCs。通过绘制生长曲线,细胞周期分析,比较三组rMSCs的生长情况。通过流式细胞仪检测细胞表面CD34,Stro-1,SH2,比较三组rMSCs的纯度。通过地塞米松诱导和免疫细胞化学染色,比较三组rMSCs的成骨分化能力。 结果:全骨髓组接种后,贴壁细胞呈梭形,密度很低,同时混杂大量圆形漂浮的造血细胞或血细胞。但经多次换液后,漂浮细胞可被去除,贴壁细胞增殖迅速,并形成集落。9-10天后可以传代。传代后随着传代次数增加,细胞增殖速度逐渐减慢,衰老形念细胞逐渐增多。可传代5-6次。密度离心组细胞呈均一梭形,呈集落样生长。接种后12-14天可以传代。传代后细胞变化与全骨髓组相似。可传代7-8次。条件培养基组接种后细胞形态与密度离心组相似,增殖迅速,5-7天后可以传代。传代细胞中衰老形念细胞出现晚于全骨髓组和密度离心组,可传代10-12次。 细胞周期分析,P₀细胞G₀/G₁期百分率,条件培养基组和全骨髓组都显著低于密度离心组。而G₂/M期百分率,条件培养组与全骨髓组都显著高于密度离心组。P₄细胞G₀/G₁期百分率,条件培养基组显著低于全骨髓组与密度离心组。S期和G₂/M期