论文部分内容阅读
口腔黏膜朗格汉斯细胞(Langerhans cell；LC)是口腔黏膜树突状细胞(Dendritic cell；DC)的独特亚群，在口腔黏膜免疫中发挥双重作用—启动对有害抗原的免疫应答和诱导对无害抗原的免疫耐受，对维持口腔黏膜稳态至关重要。口腔黏膜LC起源于骨髓前体，皮肤LC起源于卵黄囊和胎肝,二者起源不同，发育相关影响因素和机制也不尽相同。目前，调控口腔黏膜LC发育与稳态维持的分子机制还不清楚，研究其发育和稳态机制对于揭示黏膜免疫相关疾病(炎症、肿瘤和免疫耐受等)发生中LC的作用和疾病的免疫治疗都具有积极意义。LKB1(LiverkinaseB1；肝激酶B1)是抑癌基因，广泛表达于多种组织，其编码产物LKB1蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,调控生长发育、能量代谢、细胞极化等多种生理病理过程。已有研究表明LKB1在T细胞、Treg细胞、B细胞、DC等免疫细胞的发育或功能中发挥重要作用，但LKB1在LC发育与稳态维持中的可能作用目前尚无研究涉及。
目的：探索LKB1在口腔黏膜LC发育及稳态维持中的作用和相关机制。
方法：首先利用CD11ccre和LKB1fl/fl繁育条件性敲除LKB1小鼠模型(CD11ccreLKB1fl/fl )，PCR技术确定小鼠的基因型，流式细胞术检测CD11ccreLKB1fl/fl小鼠口腔黏膜LC数目及比例、迁移、增殖和凋亡情况，以及口腔黏膜LC中β-catenin的表达。使用RT-qPCR检测口腔黏膜上皮中LC发育相关基因CCL2、CCL20、Flt3L、Flt3、BMP7、TGF-β1、GM-CSF、M-CSF和IL-34的表达；其次，将WT(LKB1fl/fl；CD45.2+)与KO(CD11ccreLKB1fl/fl；CD45.2+)小鼠骨髓分别与CD45.1小鼠骨髓混合，经尾静脉回输至致死剂量辐照后的CD45.1+CD45.2+双阳小鼠体内，构建骨髓嵌合鼠模型。使用流式细胞术比较CD45.1+CD45.2+双阳小鼠体内CD45.1与CD45.2两种来源的骨髓细胞发育成口腔黏膜LC的比例；使用流式细胞术检测CD11ccreLKB1fl/fl小鼠骨髓中口腔黏膜LC前体数目和比例的变化。最后构建DC条件性敲除AMPKα1小鼠模型(CD11ccreAMPKα1fl/fl)，运用流式细胞术检测口腔黏膜LC数目及比例。
结果：成年CD11ccreLKB1fl/fl小鼠口腔黏膜LC数量及占淋巴细胞比例为160、10.48%，与野生型小鼠口腔黏膜LC数量(374)及比例(18.71%)相比较，数目降低57%(P=0.0103)，比例降低44%(P=0.0059)；CD11ccreLKB1fl/fl小鼠口腔引流淋巴结中迁移性LC的数量及占淋巴细胞比例为320、0.04191%，与野生型小鼠口腔引流淋巴结中迁移性LC数量(188)及比例(0.02892%)相比较，数目增加70.2%(P=0.0006)，比例增加44.9%(P=0.0048)，迁移性LC其表达的迁移相关受体CCR7的MFI(平均荧光强度)也升高了31.4%(CD11ccreLKB1fl/fl小鼠为11350，野生型小鼠为8638，P＜0.0001)；成年CD11ccreLKB1fl/fl小鼠口腔黏膜LC凋亡细胞占总LC的比例为49.07%，与野生型小鼠凋亡细胞(31.11%)比较显著升高(P=0.0011)，而缺陷鼠和野生型小鼠增殖细胞占总LC的比例没有差异；RT-qPCR结果显示缺陷鼠和野生型小鼠口腔黏膜上皮中LC发育相关基因的表达也没有显著差异；1∶1(CD45.1∶CD45.2)骨髓混合回输实验中，接受CD45.1与CD11ccreLKB1fl/fl小鼠混合回输鼠的CD45.1+CD45.2+小鼠口腔黏膜CD45.1+LC与CD45.2+LC的比例为77∶23，而接受CD45.1与LKB1fl/fl小鼠混合回输鼠的小鼠口腔黏膜CD45.1+LC与CD45.2+LC的比例为37∶63；1∶4(CD45.1∶CD45.2)骨髓混合回输实验中，接受CD45.1与CD11ccreLKB1fl/fl小鼠混合回输鼠的CD45.1+CD45.2+小鼠口腔黏膜CD45.1+LC与CD45.2+LC的比例为75∶25，而接受CD45.1与LKB1fl/fl小鼠混合回输鼠的CD45.1+CD45.2+小鼠口腔黏膜CD45.1+LC与CD45.2+LC的比例为17∶83；成年CD11ccreLKB1fl/fl小鼠骨髓口腔黏膜LC前体细胞CDP、Pre-DC、CMoP数目分别为120、1953、98，与对照组LKB1fl/fl小鼠(230、3958、191)相比，均显著降低(P值依次为：0.0151、0.0036、0.0482)；与AMPKα1fl/fl小鼠相比，稳态下成年CD11ccreAMPKα1fl/fl小鼠口腔黏膜LC数目和占淋巴细胞的比例无变化；稳态下成年CD11ccreLKB1fl/fl小鼠口腔黏膜LC表达β-catenin的MFI与野生型小鼠相比下调了57.3%(CD11ccreLKB1fl/fl小鼠为5814，野生型小鼠为2484，P＜0.0001)。
结论：LKB1正向调控口腔黏膜LC的发育、负向调控口腔黏膜LC的迁移与凋亡；其对口腔黏膜LC的调控不依赖AMPK，而可能通过正向调控β-catenin来实现。
目的：探索LKB1在口腔黏膜LC发育及稳态维持中的作用和相关机制。
方法：首先利用CD11ccre和LKB1fl/fl繁育条件性敲除LKB1小鼠模型(CD11ccreLKB1fl/fl )，PCR技术确定小鼠的基因型，流式细胞术检测CD11ccreLKB1fl/fl小鼠口腔黏膜LC数目及比例、迁移、增殖和凋亡情况，以及口腔黏膜LC中β-catenin的表达。使用RT-qPCR检测口腔黏膜上皮中LC发育相关基因CCL2、CCL20、Flt3L、Flt3、BMP7、TGF-β1、GM-CSF、M-CSF和IL-34的表达；其次，将WT(LKB1fl/fl；CD45.2+)与KO(CD11ccreLKB1fl/fl；CD45.2+)小鼠骨髓分别与CD45.1小鼠骨髓混合，经尾静脉回输至致死剂量辐照后的CD45.1+CD45.2+双阳小鼠体内，构建骨髓嵌合鼠模型。使用流式细胞术比较CD45.1+CD45.2+双阳小鼠体内CD45.1与CD45.2两种来源的骨髓细胞发育成口腔黏膜LC的比例；使用流式细胞术检测CD11ccreLKB1fl/fl小鼠骨髓中口腔黏膜LC前体数目和比例的变化。最后构建DC条件性敲除AMPKα1小鼠模型(CD11ccreAMPKα1fl/fl)，运用流式细胞术检测口腔黏膜LC数目及比例。
结果：成年CD11ccreLKB1fl/fl小鼠口腔黏膜LC数量及占淋巴细胞比例为160、10.48%，与野生型小鼠口腔黏膜LC数量(374)及比例(18.71%)相比较，数目降低57%(P=0.0103)，比例降低44%(P=0.0059)；CD11ccreLKB1fl/fl小鼠口腔引流淋巴结中迁移性LC的数量及占淋巴细胞比例为320、0.04191%，与野生型小鼠口腔引流淋巴结中迁移性LC数量(188)及比例(0.02892%)相比较，数目增加70.2%(P=0.0006)，比例增加44.9%(P=0.0048)，迁移性LC其表达的迁移相关受体CCR7的MFI(平均荧光强度)也升高了31.4%(CD11ccreLKB1fl/fl小鼠为11350，野生型小鼠为8638，P＜0.0001)；成年CD11ccreLKB1fl/fl小鼠口腔黏膜LC凋亡细胞占总LC的比例为49.07%，与野生型小鼠凋亡细胞(31.11%)比较显著升高(P=0.0011)，而缺陷鼠和野生型小鼠增殖细胞占总LC的比例没有差异；RT-qPCR结果显示缺陷鼠和野生型小鼠口腔黏膜上皮中LC发育相关基因的表达也没有显著差异；1∶1(CD45.1∶CD45.2)骨髓混合回输实验中，接受CD45.1与CD11ccreLKB1fl/fl小鼠混合回输鼠的CD45.1+CD45.2+小鼠口腔黏膜CD45.1+LC与CD45.2+LC的比例为77∶23，而接受CD45.1与LKB1fl/fl小鼠混合回输鼠的小鼠口腔黏膜CD45.1+LC与CD45.2+LC的比例为37∶63；1∶4(CD45.1∶CD45.2)骨髓混合回输实验中，接受CD45.1与CD11ccreLKB1fl/fl小鼠混合回输鼠的CD45.1+CD45.2+小鼠口腔黏膜CD45.1+LC与CD45.2+LC的比例为75∶25，而接受CD45.1与LKB1fl/fl小鼠混合回输鼠的CD45.1+CD45.2+小鼠口腔黏膜CD45.1+LC与CD45.2+LC的比例为17∶83；成年CD11ccreLKB1fl/fl小鼠骨髓口腔黏膜LC前体细胞CDP、Pre-DC、CMoP数目分别为120、1953、98，与对照组LKB1fl/fl小鼠(230、3958、191)相比，均显著降低(P值依次为：0.0151、0.0036、0.0482)；与AMPKα1fl/fl小鼠相比，稳态下成年CD11ccreAMPKα1fl/fl小鼠口腔黏膜LC数目和占淋巴细胞的比例无变化；稳态下成年CD11ccreLKB1fl/fl小鼠口腔黏膜LC表达β-catenin的MFI与野生型小鼠相比下调了57.3%(CD11ccreLKB1fl/fl小鼠为5814，野生型小鼠为2484，P＜0.0001)。
结论：LKB1正向调控口腔黏膜LC的发育、负向调控口腔黏膜LC的迁移与凋亡；其对口腔黏膜LC的调控不依赖AMPK，而可能通过正向调控β-catenin来实现。