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禽致病性大肠杆菌(APEC)属于肠道外致病性大肠杆菌(ExPEC)的成员,能通过呼吸道和生殖道等多种途径感染并引起禽类各种肠道外疾病。目前,该病已成为危害养禽业的重要细菌病之一,给养禽业造成了重大经济损失,尤其是那些养禽业发达的国家,例如,巴西、中国、美国。对于大肠杆菌来说铁离子是一种必需成分,但动物体内游离的铁离子浓度很低,不能满足细菌的生存要求,因此大肠杆菌进化出多种摄铁机制从宿主体内竞争铁离子,肠菌素铁摄取系统就是其中一种。铁离子对于大肠杆菌在宿主体内生存和发挥毒力起着关键作用,这使得铁摄取系统如铁结合性复合物能够成为发展新型药物的靶位点。本研究旨在研究肠菌素相关基因entE、entS、tolC与APEC致病性之间的关系,为揭示APEC的致病机理及进一步构建APEC弱毒疫苗株奠定基础。运用λRed重组系统构建E058△entE、E058△entS、E058△tolC、E058△entE△entS、 E058△entE△entS△tolC基因缺失突变株,同时将带有相应启动子的tolC基因完整阅读框插入低拷贝载体pACYC184中,通过电转化突变株来筛选获得回复株。RT-PCR结果表明entE和tolC基因均不能转录,而其上下游基因的转录不受影响。1日龄SPF鸡致死性试验结果表明,与野生株相比,E058△tolC及E058△entE△entS△tolC突变株的致病力显著降低,而E058△entE、E058△entS、E058△entE△entS突变株致弱不明显。35日龄SPF鸡体内定居与持续试验结果表明,E058△tolC和E058△entE△entS△tolC突变株在各脏器的定居与持续能力均显著低于野生株E058(P<0.0001),同时,E058△entE△entS△tolC突变株较E058Ato/C突变株的定居与持续能力显著降低。生长曲线的测定结果显示,在LB培养基中,各突变株生长速度与野生株相似,并未表现出明显差异,但在贫铁培养基中,E058△entE△entS△tolC三基因突变株的生长速度显著低于野生株,而其它突变株生长速度较野生株均没有表现出显著差异。血清杀菌试验显示各突变株和野生株没有表现出显著差异。体外竞争试验结果显示,在LB培养基中,除E058△entS外,突变株均表现为轻度致弱,而在贫铁培养基中,三基因突变株E058△entE△entS△tolC表现为中度致弱。HD-11细胞吞噬试验结果显示,与突变株E058Ato/C相比,突变株E058△entE△entS△tolC对HD-11细胞侵袭率明显增加,差异显著。这些结果表明,参与肠菌素外膜输出基因tolC与APEC E058菌株的致病性高度相关,而参与肠菌素合成基因entE和内膜运输基因entS不影响APEC的致病性。并且三基因缺失株E058△entE△entS△tolC的生长速度在贫铁条件下受到抑制,在鸡的感染模型中,这种生长方面的缺陷或许会在体内有所放大,引起致病性下降。