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背景和目的心血管疾病因其逐年增长的发病率和死亡率,一直以来受到各界广泛关注。尽管目前已有广泛可用的诊断治疗途径,心血管疾病的流行、死亡率和治疗花费在发达国家及发展中国家仍呈上升趋势。急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是世界范围内最常见的心血管疾病之一,为有效控制AMI的发生和发展,寻求新的诊断和治疗的指标和方法十分必要。近年以来,研究表明mi RNA在疾病发生发展中可通过靶向调节其下游靶基因发挥作用。在多个研究领域都得到广泛重视,包括肿瘤、心血管疾病等等。已发现多种mi RNA在急性心肌梗死患者血液和血浆中发生改变,如mi R-1、mi R-133a,mi R-208b,mi R-499,和mi R-328,提示循环mi RNA在AMI早期诊断中具有价值。本实验的目的是筛选AMI发生时血液循环中异常表达的mi RNA;分析异常表达mi RNA表达水平变化,并判断其作为辅助诊断的价值;初步探索AMI发生时异常表达mi RNA发挥调控作用的可能途径。第一部分急性心肌梗死发生时血液循环中异常表达mi RNA筛选和鉴定方法1.收集30例AMI患者和30例健康成人志愿者的血浆样本。2.采用Agilent mi RNA芯片分别检测随机选取3例AMI患者和3例健康成年志愿者血浆中mi RNA的表达情况,筛选有显著差异表达的mi RNA。3.应用q RT-PCR的方法检测30例AMI患者和30例健康成人志愿者的血浆样本中mi RNA芯片筛选出的有差异表达的mi RNA的表达情况,对mi RNA芯片的结果进行验证。4.应用统计学软件SPSS21.0对实验数据进行统计学分析,检验标准α=0.05。结果1.通过mi RNA芯片检测出共有36种mi RNA在AMI患者血浆中出现异常表达,其中有23种mi RNA表达水平显著升高(P<0.05),13种mi RNA表达水平明显下降(P<0.05)。2.q RT-PCR验证的结果表明30例AMI患者血浆中除mi R-361-5p,mi R-182-5p,mi R-497-5p,mi R-20a-5p四种mi RNA表达水平与正常对照组相比无显著性差异(P>0.05),其余32种mi RNA表达水平较正常对照组相比出现显著性变化(P<0.05),其中上调的mi RNA有20种,下调的mi RNA有12种。第二部分AMI发生时血液循环中mi R-486,mi R-150和mi R-26a表达变化分析及作为辅助诊断的价值方法1.收集110例AMI和110例健康成人志愿者的血浆样本,110例AMI患者中分别有45例NSTEMI患者和65例STEMI患者,采集入院之后发病4h以内,24h,48h,72h的血浆样本。2.q RT-PCR法检测mi R-486,mi R-150和mi R-26a在AMI各类型各时间段血浆样本中的表达水平。3.应用受试者工作特性曲线(ROC)反映灵敏度与特异度,应用ROC曲线下面积(AUCROC)比较mi R-486,mi R-150和mi R-26a对AMI的辅助诊断价值。4.应用统计学软件SPSS21.0处理所有数据,检验标准α=0.05。结果1.AMI发作4h以内,mi R-486和mi R-150表达量分别为9.655±1.427和7.420±0.911,与正常对照组相比表达水平均显著上调(P<0.05);mi R-26a表达量为0.092±0.104,与正常对照组相比表达水平显著下调(P<0.05)。2.AMI发作4h以内,24h,48h,72h,mi R-486和mi R-150表达水平均随时间延长逐渐降低,至72h时与正常对照组无显著性差异(P>0.05);mi R-26a表达水平随时间延长逐渐升高,至72h时与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。3.AMI发作4h以内,mi R-486,mi R-150和mi R-26a的AUC曲线下面积分别为0.731(P<0.05),0.678(P<0.05),0.763(P<0.05),表明这三种mi RNA的表达水平检测对检测AMI的发生有一定的价值。这三种mi RNA联合检测的AUC曲线下面积为0.792(P<0.05),表明具有更高的诊断价值。4.AMI发作4h以内,mi R-486,mi R-150和mi R-26a表达在AMI的两种类型STEMI和NSTEMI中存在显著性差异。mi R-486,mi R-150和mi R-26a在STEMI中的AUC曲线下面积分别为0.695(P<0.05),0.639(P<0.05),0.750(P<0.05),表明这三种mi RNA的表达水平检测对检测STEMI的发生有一定的价值;mi R-486,mi R-150和mi R-26a在NSTEMI中的AUC曲线下面积分别为0.782(P<0.05),0.734(P<0.05),0.782(P<0.05),表明这三种mi RNA的表达水平检测对检测NSTEMI的发生有一定的价值;在STEMI和NSTEMI时这三种mi RNA联合检测的AUC曲线下面积分别为0.765(P<0.05),0.833(P<0.05),说明三者联合检测具有更高的灵敏度和特异度,且在NSTEMI时具有更高的诊断价值。第三部分mi R-486,mi R-150在AMI发生时的作用机制的初步探索方法1.通过Target Scan和mi Randa寻找可能与mi R-486,mi R-150相关的靶基因2.用Overlap PCR的方法扩增突变型CDKN1B 3’UTR和ALDH2 3’UTR片段,用普通PCR来扩增野生型CDKN1B 3’UTR和ALDH2 3’UTR片段,将扩增出来的片段与pmir GLO双粘载体进行重组,从而分别构建野生型和突变型CDKN1B 3’UTR和ALDH2 3’UTR的重组双荧光素酶报告载体。3.将野生型和突变型CDKN1B 3’UTR重组报告载体分别与mi R-150 mimics或者mi R-150 scramble共同转染到HEK 293T细胞中;将野生型和突变型ALDH2 3’UTR重组报告载体分别与mi R-486 mimics或者mi R-486 scramble共同转染到HEK 293T细胞中。通过双荧光素酶报告实验验证CDKN1B是否为mi R-150的靶基因,ALDH2是否为mi R-486的靶基因。4.应用统计学软件SPSS21.0处理所有数据,检验标准α=0.05。结果1.生物信息学检测发现基因CDKN1B的3’UTR区可能是mi R-150的一个下游直接作用靶点,ALDH2的3’UTR区可能是mi R-486的一个下游直接作用靶点。2.经酶切验证,PCR验证和测序结果验证,成功构建了野生型和突变型CDKN1B 3’UTR和ALDH2 3’UTR的重组双荧光素酶报告载体。3.双荧光素报告酶实验显示,mi R-150 mimics和WT-pmir GLO-CDKN1B共转染组荧光素酶活性为0.54±0.065,显著低于其他三个共转染组(P<0.05),表明CDKN1B是mi R-150作用的靶基因;mi R-486 mimics和WT-pmir GLOALDH2共转染组荧光素酶活性为0.62±0.045,显著低于其他三个共转染组(P<0.05),表明ALDH2是mi R-486作用的靶基因。结论1.急性心肌梗死患者循环血液中,存在32种mi RNA出现表达异常,20种mi RNA表达明显上调,12种mi RNA表达明显下调。2.急性心肌梗死发作4h以内,mi R-486和mi R-150表达水平明显上调,mi R-26a表达水平明显下调,且随时间延长变化趋势越不明显。mi R-486,mi R-150和mi R-26a联合检测有望成为急性心肌梗死的辅助诊断指标,尤其适用于NSTEMI的辅助诊断。3.mi R-150和mi R-486分别负向调节CDKN1B和ALDH2的表达,可能在急性心肌梗死发生发展中发挥一定作用。