大肠埃希菌俗称大肠杆菌,是一类在自然界中广泛分布的革兰阴性菌。根据其致病性及致病机理的不同,大肠杆菌被划分为共生型大肠杆菌(Commensal Escherichia coli)、肠道致病性大肠杆菌(Intestinal pathogenic Escherichia coli,IPEC)以及肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)。肠道外致病性大肠杆菌是一类机会致病菌,长期地无症状地定殖于宿主肠道中。当宿主环境适宜时,能引起宿主的肠道外感染。ExPEC主要包括禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)、致新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal meningitis-associated Escherichia coli,NMEC)以及尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)。APEC可引起多种家禽的急性或慢性感染,导致全身、多组织器官的病变。人源ExPEC可以导致新生儿脑膜炎以及尿道感染。ExPEC潜在的人畜共患性严重威胁人类和动物的健康,加强对ExPEC防控的研究,对养禽业和公共卫生均具有重要的意义。在ExPEC的防控中目前存在着两个难题。首先,依赖于抗生素的防控造成了大肠杆菌耐药菌株的涌现以及抗生素残留问题,需要新的替代方法。大肠杆菌血清型众多,疫苗间交叉保护力弱,限制了疫苗免疫防控手段的开展。其次,ExPEC的致病机理不清楚。与IPEC相比,在致病过程中,ExPEC面临的环境更加复杂,需要躲避更多的宿主天然免疫系统的杀伤机制。目前虽然在ExPEC中鉴定出大量的毒力相关因子,但是这些毒力因子在致病过程中的作用仍然不是十分清楚。而关于ExPEC抵抗宿主天然免疫系统的机制更是知之甚少。本研究一方面试图通过蛋白质组学方法筛选ExPEC保护性抗原,并对其作为亚单位疫苗的可能性进行评估,另一方面通过转座子突变文库以及基因缺失技术,研究ExPEC躲避宿主天然免疫系统中溶菌酶杀伤作用的机制。1.APEC临床分离株的毒力评估根据菌株分离的时间和地点,从2007年～2011年在南京周边地区等地分离的467株鸭源APEC临床分离株中,挑取32株菌株作为代表菌株。通过新生SD大鼠细菌性脑膜炎模型,对这些菌株的毒力以及跨血脑屏障的能力进行了检测。并且利用PCR方法,从种系发育群和毒力因子分布两方面对受测菌株的分子特性进行分析。结果显示:各APEC菌株对新生SD大鼠的致死率从0%～100%不等,菌株间毒力差异较大。其中,有26株菌株能够从新生SD大鼠的脑脊液中重新分离获得,说明这些菌株具有穿透血脑屏障的能力。种系发育群分析发现,所有8株B2群菌株均能跨过血脑屏障,且其中4株菌株对新生大鼠的致死率接近100%,提示B2群菌株毒力更强,更易导致脑膜炎的发生。在毒力因子分布试验中,仅hlyA未在受测菌株中扩增出目的条带,其他基因均有分布。Cnf1/2的检出率最低,在1株不具有穿透血脑屏障的APEC菌株中检出。GimB和neuC是NMEC重要的毒力因子,检出率分别为9.375%和12.5%,分布于具有穿透血脑屏障的APEC菌株中,提示它们可能在APEC跨血脑屏障的过程中也发挥重要的作用。在检测的16个毒力相关因子中,14个基因分布于菌株DE205B。该菌株将作为研究APEC免疫保护性抗原的研究对象。2.APEC免疫保护性抗原的筛选及免疫效果的评价大肠杆菌血清型众多,疫苗的交叉保护力差,成为大肠杆菌疫苗研发的一个难题。为了寻找具有交叉保护力的亚单位疫苗,免疫蛋白质组学以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)被运用于APEC的免疫保护性抗原的筛选。提取APEC菌株DE205B(02:K1)的全菌蛋白,经二维电泳分离后,与鸭抗DE205B高免血清反应。结果鉴定出14个具有免疫反应性的蛋白点,分别代表11个不同的蛋白,包括外膜蛋白A(OmpA)和鞭毛蛋白(FliC)两个已知的免疫原。分子伴侣家族成员GroEL和另外8个蛋白是首次在APEC中发现的具有免疫反应性的蛋白。通过体外表达系统,成功表达了9个基因的重组蛋白。Western blotting结果显示,7个重组蛋白能够与鸭抗DE205B高免血清反应,其中重组蛋白GroEL、OmpA和FliC显示出较强的免疫反应性。攻毒保护实验结果显示,与已知的免疫原性蛋白OmpA和FliC一样,重组蛋白GroEL能够刺激动物机体产生高水平抗体,有一定的交叉免疫保护力。因此,GroEL可能是一种理想的免疫原,可作为APEC亚单位疫苗的候选对象。3.NMEC抗溶菌酶相关基因的筛选及缺失株的构建致新生儿脑膜炎大肠杆菌属于肠道外致病性大肠杆菌,是导致新生儿细菌性脑膜炎最主要的革兰阴性致病菌。在致病过程中,NMEC需要躲避宿主的先天免疫系统,在宿主的血液中存活并且增殖。溶菌酶是先天免疫系统中重要的防御物质之一,广泛的分布于宿主各组织细胞中,发挥着抵抗病原微生物入侵和清除入侵病原菌的作用。近年来虽然多种大肠杆菌溶菌酶抑制因子被发现,但是大肠杆菌逃避溶菌酶介导的杀伤作用的机制仍然不是十分清楚。因此,本试验利用PUT mini-Tn5 Km质粒,构建了一个含有15000个转座子突变株的突变文库用以筛选抗溶菌酶菌株NMEC38中与溶菌酶抗性相关的基因。结果鉴别出25个突变株,分别代表20个基因。其中,14个基因编码多种生物合成相关的酶,包括多糖的合成;1个基因编码DctM家族转运蛋白;1个基因编码PTS依赖的二羟基丙酮激酶操纵子调节蛋白;其余4个基因编码多个假定蛋白,具体功能未知。在这些转座子突变株中,菌株F172对溶菌酶敏感性最高。对转座子插入位点分析发现,包括F172在内的9个菌株(代表6个基因)的插入位点均位于galF至gnd基因簇之间。利用λred同源重组方法构建了galF至gnd基因簇内溶菌酶抗性相关基因的缺失株并进行了特性分析,结果显示与野生株相比,缺失株对溶菌酶的抗性均显著下降,且外膜的通透性也有不同程度的增加。4.NMEC脂多糖抑制溶菌酶活性的鉴定及分析脂多糖是革兰阴性菌所特有的细胞壁成份,具有广泛的生物学功能。在前期试验筛选获得的20个与溶菌酶抗性相关的基因中,6个基因位于galF至gnd基因簇。在大肠杆菌中,该基因簇常常与脂多糖O抗原的生物合成有关。为了研究这些基因在病原菌抗溶菌酶过程中的作用,提取了野生株NMEC38、缺失株和互补株的脂多糖。SDS-PAGE结果显示,野生株NMEC38的LPS图谱呈现多条条带,以梯级状排列;而缺失株LPS图谱中仅在靠近胶底处出现1～3条条带,说明缺失株的LPS结构发生了改变。Western blotting结果证实缺失株LPS缺失了O特异性侧链多糖部分。溶菌酶抑制试验和凝胶过滤层析试验证实NMEC38 LPS能够结合溶菌酶,抑制溶菌酶活性,协助病原菌抵抗溶菌酶的杀伤作用。利用酸水解法,进一步将野生株LPS裂解为O特异性侧链多糖和脂质A两部分。结合试验证实不论是侧链多糖还是脂质A均能与溶菌酶结合。但是,溶菌酶水解酶活性抑制试验显示只有O特异性侧链多糖能够抑制溶菌酶水解酶活性,提示脂多糖对溶菌酶的抑制作用是通过0特异性侧链多糖发挥作用。