原发性高血压(EssentialHypertension, EH)简称为高血压,为一种独立的心血管疾病,是导致多种心脑血管疾病的重要病因及危险因素,可影响心、脑、肾等多个重要脏器的结构和功能,最终导致这些重要器官的功能减退及衰竭,已经成为心血管疾病死亡的主要原因之一。现已证实心血管重构及靶器官损害与高血压的预后是密切相关的,因此,高血压病的现代治疗策略认为不应只局限于降低血压,更重要的是保护靶器官免受损伤,逆转心肌肥厚和血管重构(vascular remodeling, VR),这样才能有效降低高血压并发症的发生率和病死率。因此,对高血压状态下血管重构及靶器官损害机制的研究具有重要意义。哇巴因(ouabain)是一种新发现的类固醇类的肾上腺皮质激素,作为内源性的洋地黄物质,为主要的钠泵抑制物之一。诸多研究表明,哇巴因含量升高与原发性及继发性高血压发病密切相关。目前研究一致认为哇巴因与细胞膜上的钠泵结合后,可以使得钠泵的构型发生改变及功能受到抑制,血管内皮细胞出现继发性改变,最终导致血压升高。近年来国外学者通过给予大鼠长期注射小剂量哇巴因,建立起一种新的高血压模型即哇巴因高血压大鼠,该高血压模型的许多特点都与原发性高血压患者(尤其是低肾素型高血压)非常相似,目前已经成为高血压发病学研究中的一个有价值的动物模型。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract, GSPE)是一种抗氧化作用极强的生物制剂,它具有强大的自由基清除能力,可以减少或清除氧自由基对机体组织和器官的损害作用。已有大量的研究发现,葡萄籽原花青素通过抗氧化损伤作用可以预防大鼠心脏的缺血再灌注损伤。除了强大的抗氧化作用,GSPE还具有保护血管内皮作用及抗炎作用。而有关GSPE在高血压方面的研究,目前国内外尚未见报道。因此本研究应用哇巴因构建高血压大鼠模型观察哇巴因导致高血压所致心、脑、肾、血管等重要脏器的损害,同时给予天然药物GSPE干预,观察其对哇巴因高血压大鼠血压及血管重构的影响,并进行RT-PCR及Western Bloting检测主动脉NF-κB和TGF-β1的基因和蛋白表达,探讨GSPE对哇巴因高血压大鼠靶器官的保护机制。第一部分哇巴因高血压大鼠模型建立及重要靶器官损害的研究研究背景：流行病学资料显示,我国人群高血压患病率上升很快,估测目前全国有高血压患者约1.6亿。因此,我们面临的高血压防治任务是非常艰巨的。高血压导致脑、心、肾和主动脉等重要靶器官的病理改变,往往与血管结构和功能改变有着密切联系,血管重构是其基础。除了异常的血流动力学因素外,血液循环中的血管紧张素Ⅱ、血栓素、炎性因子、内皮素、氧化低密度脂蛋白等多种因素均可作为信号,被内皮细胞等感受器所感受,再通过多种信号转导途径传导至其他感受器和效应器,进而释放调节因子如生长因子、细胞因子、基质调节因子和血管活性物质等,引起血管结构和功能的变化。由于高血压的发病机制与高血压引起的病理生理变化很难截然分开,血压的波动性和高血压定义的人为性以及发病时间的模糊性也使高血压血管重构及靶器官损害的始动机制很难确定。目前逆转血管重构、保护靶器官亟待解决的问题是明确血管重构及靶器官损害是否始动于高血压之前,从而在血管重构及靶器官损害的初始阶段即采取干预措施,以有效降低高血压的致残率和致死率。本文以雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠为实验动物,通过长期小剂量腹腔注射哇巴因观察其引起大鼠血压升高的作用,并观察大鼠脑、心、肾、主动脉等主要靶器官的病理变化,探讨哇巴因是否具有独立于血压升高的直接靶器官损害作用以及哇巴因导致这些靶器官发生病理改变的可能机制,同时也为高血压血管重构及靶器官损害的机制研究提供一个新的契机,进而为寻找高效且有逆转血管重构、保护靶器官的治疗高血压药物奠定理论基础。研究方法：40只雄性SD大鼠适应性饲养5天后进入实验,随机分为2组：哇巴因组20只,每日晨腹腔注射哇巴因27.8μg·kg-1；正常对照组20只,每日晨腹腔注射生理盐水1 mL。第3周末每组随机处死各10只,剩余20只大鼠于第6周末全部处死。1.实验开始前及开始后每周末测量大鼠尾动脉收缩压1次。收缩压测量采用大鼠尾动脉间接测量法—尾套法。2.实验开始后的第3周末和第6周末,留取脑、心、肾、主动脉和肠系膜动脉等标本进行HE染色、电镜观察。另外留取大脑皮质进行尼氏体(Nissl)染色、主动脉切片行天狼猩红饱和苦味酸染色。结果：1.哇巴因组大鼠的血压逐渐升高,至6周末哇巴因组大鼠的血压开始明显升高并高于同周龄的正常对照组大鼠。2.3周末,哇巴因组大鼠主动脉电镜观察发现结构改变,而6周末哇巴因组大鼠主动脉出现内膜增厚,血管重构改变,心肌细胞肿胀,肌丝排列紊乱。结论：1.小剂量哇巴因长期腹腔注射6周后SD大鼠的血压明显升高,可成功建立哇巴因高血压大鼠模型。2.哇巴因高血压大鼠在血压明显升高之前即出现了主动脉等主要靶器官的超微结构损害,提示病理浓度的哇巴因可导致主要靶器官的损害,且该作用的发生始于哇巴因升高血压之前。3.哇巴因高血压大鼠是较为理想的高血压动物模型。第二部分GSPE对哇巴因高血压大鼠靶器官的保护机制研究研究背景：原发性高血压(EH)的发病原因是多种多样的,而高血压靶器官的损害机理究竟为何尚不明确。因此探寻靶器官损害的机理、寻找安全有效的药物干预高血压及靶器官损害的发展过程显得尤为必要。葡萄籽原花青素(GSPE)是从葡萄籽中提取出来的一类多酚化合物的总成,它具有多种生物学活性,具有潜在的临床应用价值。目前已经有大量研究发现GSPE具有极强的抗氧化活性,在动脉粥样硬化、缺血再灌注以及化疗药物引起的心肌损伤中可发挥保护作用。哇巴因作为一种内源性的洋地黄物质,是主要的钠泵抑制物之一。可以诱导高血压的发生,诱导高血压靶器官损害的出现。因此本研究应用哇巴因构建高血压大鼠模型,在建立模型的同时给予GSPE灌胃治疗,观察GSPE对哇巴因性高血压大鼠血压水平的影响,同时,对主动脉进行光镜、电镜观察,探讨GSPE对高血压血管重构能否起到保护性作用,对NF-κB即TGF-β1进行荧光定量PCR和Western bloting检测,并探讨其可能存在的机理。研究方法：40只雄性SD大鼠随机分为2组：哇巴因组20只,每日清晨腹腔注射哇巴因27.8μg·kg-1+生理盐水1ml灌胃；GSPE治疗组20只,每日晨腹腔注射哇巴因27.8μg·kg-1+GSPE 250mg·kg-1灌胃。6周后实验结束时,留取主动脉进行HE染色、天狼猩红染色、免疫组织化学染色、透射电子显微镜观察、将另取部分组织至—80℃冰箱保存,对NF-κB及TGF-β1进行荧光定量PCR和Western bloting检测。结果：1.GSPE能够显著降低哇巴因高血压大鼠的血压,这表明GSPE具有一定的降压作用。2.哇巴因组大鼠主动脉血管重构较重,而GSPE组能够抑制哇巴因高血压大鼠主动脉血管重构。3.通过RT-PCR及Western Bloting技术,发现GSPE治疗后,能够显著抑制哇巴因高血压大鼠主动脉NF-κB p65以及TGF-β1 mRNA的表达(P<0.05或0.01)。结论：1. GSPE具有保护哇巴因高血压大鼠靶器官损害的作用。2. GSPE在一定程度下可降低哇巴因高血压大鼠高血压的进程,延缓血管重构的发生。3. GSPE通过抑制NF-κB/TGF-β1途径,减轻大鼠主动脉组织中的炎症反应,起到保护哇巴因高血压大鼠血管重构的作用。