人维生素K环氧化物还原酶(h VKOR)是位于内质网的整合膜蛋白,通过催化维生素K循环中的限速步骤,参与维生素K依赖性蛋白的翻译后修饰。临床常用抗凝血药华法林通过特异性靶向h VKOR,阻断维生素K循环,使肝脏合成的凝血因子的γ-羧基化受抑制而产生抗凝作用。目前,h VKOR催化维生素K环氧化物(KO)的机制是基于量子化学理论提出的,但是在细胞环境中具体的催化机制尚不清楚。因此,深入研究生理条件下h VKOR催化KO的催化机理具有重要的理论意义,也有助于我们理解华法林的抑制机制。目的:通过构建野生型h VKOR以及突变体的稳定细胞系,利用凝胶迁移实验、定量质谱以及分子模拟等方法,捕捉h VKOR在催化KO过程中形成的电子转移中间体,进一步揭示细胞环境下h VKOR催化KO的催化机制。方法:1.以pc DNA5/FRT为载体,利用快速克隆的方法构建表达野生型h VKOR以及相关半胱氨酸突变体的重组质粒,通过测序验证其是否构建成功。2.体外常规培养293T-REx细胞,将测序成功的重组质粒pc DNA5/FRT与p OG44以1:10的比例共转染293T-REx细胞。48h后,向培养基中加入一定浓度的抗生素(杀稻瘟菌素和潮霉素)筛选稳定的细胞系;通过向培养基中加入强力霉素,诱导目的蛋白表达。3.建立KO诱导的凝胶迁移实验。将稳定表达野生型h VKOR以及相关半胱氨酸突变体的细胞分为KO处理组与未处理组,分别进行还原和非还原的SDSPAGE电泳,用Western Blot检测KO处理对h VKOR各突变体电泳迁移的影响。4.从稳定细胞系中纯化表达野生型h VKOR以及各半胱氨酸突变体的蛋白,用定量质谱的方法分析每个半胱氨酸的氧化还原态。5.结合细菌ss VKOR的结构,利用计算机模拟的方法分别构建h VKOR与KO以及h VKOR与华法林结合形成的复合物结构模型。结果:1.利用pc DNA5/FRT成功构建表达野生型h VKOR以及各突变体的重组质粒。2.利用293T-REx细胞成功构建稳定表达野生型h VKOR以及各突变体的细胞系。3.KO诱导的凝胶迁移实验结果显示,C43A突变体在加入KO处理之后,在非还原的SDS-PAGE电泳中出现了一个迁移带,迁移现象在还原的SDSPAGE电泳中消失,而其它突变体并未出现迁移现象。在C43AC135A、C43AC135S双突变体中,用同样的方法经KO诱导处理后,进行非还原的SDSPAGE电泳,发现C43A中KO诱导的凝胶迁移在这两个双突变体中均消失。4.对野生型h VKOR和各突变体进行定量质谱分析,结果显示C43A突变体中的C135在加入KO处理后变为氧化态,并且KO处理还诱导了C43A突变体中更多的C16和C85处于氧化态;其它突变体的C135在KO处理前后氧化还原态的变化不明显,除C43A突变体外,其它突变体中C16、C85、C96在KO处理前后氧化还原态无明显变化。结合以上结果,我们构建出h VKOR催化KO的催化机制模型。5.利用计算机模拟的方法成功构建了h VKOR与KO以及h VKOR与华法林结合的复合物结构模型,提示KO与华法林结合同一个口袋,进而我们提出一个华法林抑制h VKOR的模型。结论:1.在细胞内h VKOR具有两种或三种活性形式,分别是C51-C132形成二硫键并且C43和C135为游离巯基的状态以及具有C132和C135两个游离巯基的状态。这几类状态催化KO的效率可能不同。2.由于细胞内h VKOR存在两种或三种活性形式,因此细胞内h VKOR催化KO到K存在多个催化机制,细胞内h VKOR催化KO是一个混合催化机制。3.基于细胞内h VKOR催化KO的混合催化模型,我们认为华法林通过混合抑制模式抑制h VKOR的活性。