研究背景与研究目的原发性血小板增多症(Essential thrombocythemia, ET)是一组以骨髓巨核细胞和外周血血小板持续增高为主要临床特征的骨髓干细胞恶性克隆性疾病。ET患者因功能缺陷的血小板过多易导致血管栓塞和出血,重要脏器栓塞和出血常常危及患者生命。科学家们发现约55%ET患者携带JAK2/V617F突变,约25%ET患者携带网钙蛋白(CALR)基因突变,3%的ET患者携带血小板生成素(thrombopoietin, TPO)受体MPL基因突变。然而,仍有近20%的ET患者并不携带其中任何一种基因突变。这表明ET的发病机制还未被完全阐明。在关于MPN信号通路的研究中发现,ET患者骨髓中P-STAT3和P-STAT5表达升高,且与JAK2/V617F阴性的ET患者相比,携带JAK2/V617F的ET患者骨髓中P-STAT5表达显著升高,而P-ATAT3的表达并无差异。在携带JAK2/V617F的小鼠模型中,科学家们证实STAT5的JAK2/V617F导致骨髓增值性疾病中必要的分子信号,而并不依赖于STAT3等细胞信号分子。这说明,JAK/STAT是携带JAK2/V617F的ET患者发病中的重要通路,尤其是STAT5;而ET患者中异常活化的STAT3还存在其他的重要的上游启动信号。血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor, PDGF)最早发现于活化血小板中,是一种重要的内源性生长因子,它的受体PDGFR是酪氨酸酶家族之一。PDGF通过磷酸化作用于PDGFR,而启动一系列细胞信号通路发挥其生物学效应。Kaminski WE等发表在Blood上的文章表明,敲除小鼠的PDGF-B和PDGFR-β基因可诱发包括血小板减少在内的一系列血液系统缺陷。这提示PDGF与造血系统有密切关系,并且已经有研究证实PDGFR在巨核细胞表明的表达。在骨髓抑制小鼠模型中, PDGF能促进其血小板的恢复；并且细胞实验中进一步证实PDGF通过作用于PDGFR,顺而激活巨核细胞PI3K/AKT信号通路,促进巨核细胞增殖同时抑制其凋亡。然而,PDGF/PDGFR与血小板疾病的关系却鲜有报道。在Blood有研究报道,PDGF在ET患者外周血血清中表达显著升高,且进一步被证实为PDGF-BB亚型。因此,我们提出PDGF/PDGFR可能在原发性血小板增多症的发病机制中有潜在的作用。酪氨酸激酶抑制剂,如伊马替尼(Imatinib),最早被用于治疗BCR-ABL阳性慢性粒细胞白血病。近年来,随着对酪氨酸激酶抑制剂的作用靶点的不断认识,其在血液系统疾病的应用也不局限于ph阳性的慢性粒细胞白血病和ph阳性的急性淋巴细胞白血病。作为酪氨酸激酶家族成员之一,PDGFR的活性及其诱导的生物学效应也会相应地被伊马替尼阻断,如酪氨酸激酶抑制剂对伴有PDGFRB突变的MPN和ph样ALL治疗有效率近100%,但其针对PDGFR治疗原发性血小板增多症还未见报道。本研究目的,检测原发性血小板增多症患者PDGF及PDGFR的表达水平,并通过动物实验观察增高的PDGF水平对血小板生成的影响,明确其在ET发病中的作用；进一步探索PDGF/PDGFR于ET发病中的分子机制；并以PDGFR为靶点,探索酪氨酸酶抑制剂,伊马替尼对ET的治疗作用。研究内容与研舫法一、检测ET患者PDGF-BB及PDGFR-p的表达水平1、研究对象研究对象为2012年5月到2014年4月因外周血血小板增多(血小板>450×109/L)就诊于本研究单位,通过骨穿结果,分子生物学结果,排除继发性血小板增多,诊断为原发性血小板增多症的患者；对照组为本单位造血干细胞移植健康供者。2、酶联免疫吸附试验测ET患者及正常人骨髓血清PDGF-BB表达标本来源于骨髓,用EDTA抗凝管收集标本后,600g离心15 min,分离上清液冻存于-80℃冰箱,统一检测。将标本和试剂盒于室温解冻,根据既往文献报道人血清中PDGF-BB浓度,用PBS将标本稀释5倍；所有标本一式3份加样；加样后室温震荡孵育2.5 h,清洗后加抗体室温震荡孵育1 h后清洗,加显色剂后,于酶标仪显色,读取吸光度。3、流式细胞技术检测ET患者PDGFR-β的表达来源于骨髓的标本收集血清后,剩余细胞用溶血液溶解红细胞后,离心,用PBS洗涤两遍,剩余细胞为用PBS重悬使细胞浓度为1×107/ml,加入CD 140b-PE 20μl/100μl,室温避光温孵育30 min后洗涤,重悬于PBS,每管取1×106个细胞,上机。二、体内观察PDGF-BB对小鼠血小板生成的影响取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠16只,随机分为正常对照组(Control组,生理盐水腹腔注射),PDGF组(PDGF,1.5ug/kg/d), imatinib组(imatinib,50mg/kg/d), PDGF+imatinib组(PDGF,1.5ug/kg/d+ imatinib,50mg/kg/d),每组4只,连续21天按照分组分别通过腹腔注射给予PDGF因子,灌饲伊马替尼。分别于第0、7、21天检测各组小鼠外周血象。三、PDGF-BB促血小板生成的分子机制1、流式细胞技术检测PDGF-BB对巨核细胞JAK2/STAT3信号通路活化的影响巨核细胞株CHRF-288用完全培养基(10%胎牛血清+1640培养基)培养；分为对照组、PDGF组、伊马替尼组、PDGF+伊马替尼组。实验前,CHRF-288细胞用低血清培养基(1%胎牛血清+1640培养基)饥饿一晚,对应组别,分别加入伊马替尼(5 mmol/L),置于孵箱中(5%二氧化碳,37度)孵育1h后,对应分别加入PDGF-BB (200ng/ml),孵箱中孵育30-60 min后收集各组细胞。在各组细胞中分别加入4%多聚甲醛,固定细胞10 min后,加入破膜液,置于冰上冰孵30 min。细胞破膜后,收集并清洗各组细胞,各组细胞对应加入P-JAK2、 P-STAT3抗体,常温孵育30-60 min后,洗涤,PBS重悬,上机。2、Western blot检测PDGF-BB对巨核细胞PI3K/AKT信号通路的影响巨核细胞株CHRF-288用完全培养基(10%胎牛血清+1640培养基)培养；分为对照组、PDGF组、伊马替尼组、PDGF+伊马替尼组。实验前,CHRF-288细胞用低血清培养基(1%胎牛血清+1640培养基)饥饿一晚,对应组别,分别加入伊马替尼(5 mmol/L),置于孵箱中(5%--氧化碳,37度)孵育1h后,对应分别加入PDGF-BB (200ng/ml),孵箱中孵育30-60 min后收集各组细胞。提取蛋白,用BCA法检测蛋白浓度,并调整蛋白浓度使得每孔加入等量蛋白样品。加入蛋白样品后,进行凝胶电泳分离后电转移至硝酸纤维素膜上,室温封闭2 h,孵育抗体,洗膜,用化学发光底物试剂检测蛋白条带,读取条带。四、统计学分析实验数据分析采用SPSS 19.0统计学软件,对于连续型变量,首先进行正态性分布检验,对于符合正态性分布的数据采用均数±标准差表示,两组计量资料的均值比较采用独立样本t检验,多组之间的比较采用完全随机设计单因素的方差分析(one-way ANOVA);对于不符合正态分布的数据,两组间均值比较采用秩和检验,Mann-Whitney检验方法；多组之间比较采用Kruskal-Wallis H检验；当户<0.05时认为差异具有统计学意义。研究结果一、ET患者PDGF-BB及PDGFR-β的表达1、ET患者骨髓PDGF-BB表达用ELISA方法共检测了原发性血小板增多症患者(n=16)和正常对照组(n=8)血清PDGF-BB表达水平。根据吸光度算出ET患者和正常对照组骨髓血清PDGF-BB浓度。原发性血小板增多症患者骨髓血清中PDGF-BB浓度为2070.92±123.98 pg/ml,显著高于正常组对照组(1381.85±128.37pg/m1)(P=0.002)。2、ET患者骨髓细胞PDGFR-β的表达通过流式细胞技术检测ET患者和正常对照组骨髓细胞PDGFR-β的表达。ET患者(图2B)PDGFR-β的表达显著高于正常人；共检测了ET患者(n=6)和正常人(n=3)。首先对各组比较结果进行Levene检验,方差不齐,F=8.824,P=0.021；组间比较采用Mann-Whitney检验方法,发现ET患者骨髓细胞中PDGFR-β的表达显著高于对照组骨髓细胞的表达(P=0.02)。二、体内观察PDGF-BB对小鼠血小板生成的影响1、PDGF-BB对小鼠外周血的影响实验前,各组小鼠血小板数目无明显差异。21天时,PDGF组小鼠血小板数目明显高于正常对照组(537±15×109/L vs 454±9×109/L,n=4,P=0.006).说明在小鼠体内,高浓度的PDGF-BB可以显著促进小鼠血小板的生成,使血小板异常升高,可能是ET发病的机制之一。为了进一步研究PDGF-BB促进小鼠血小板升高是否是通过PDGFR,我们用伊马替尼灌饲PDGF-BB高水平小鼠,并比较其血小板水平与高浓度PDGF组小鼠血小板水平的差异。发现在21天时,伊马替尼联合PDGF组小鼠的血小板数目显著低于PDGF组(424±25×109/L vs537±15×109/L,n=4,P=0.001),而伊马替尼组小鼠较正常组小鼠血小板无明显变化。说明,PDGF的促血小板生成作用是通过作用于PDGFR,而伊马替尼可以有效得阻断该作用。实验前和21天时各组小鼠白细胞、红细胞数目无明显差异,说明升高的PDGF水平选择性得对血小板有升高作用,而对白细胞和红细胞并无作用。2、小鼠骨髓病理切片21天后,将各组小鼠全部处死后进行骨髓组织学分析,发现各组小鼠红系和粒系增生程度无明显差异,但PDGF组小鼠骨髓组织巨核细胞数明显多于对照组；而与PDGF组相比,PDGF联合imatinib组小鼠骨髓组织中巨核细胞明显减少,并且退化及凋亡的巨核细胞明显增多。综上所述,小鼠骨髓病理结果与小鼠外周血结果相一致,PDGF处理组小鼠骨髓巨核系增生活跃,导致外周血小板升高,而加入imatinib后,可以阻断PDGF/PDGFR对巨核系的促增殖作用,并促进巨核细胞的凋亡,从而有效阻断PDGF对小鼠外周血小板的促生成作用。三、 PDGF-BB对巨核细胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信号通路的影响1、PDGF-BB对巨核细胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信号通路的影响JAK2/STAT3、PI3K/AKT信号通路对巨核细胞的增殖、分化和成熟有重要作用。分别用流式细胞技术和Werstern blot技术探究PDGF-BB对巨核细胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信号通路活化的影响。PDGF-BB可以使CHRF-288细胞株P-JAK2、P-STAT3、P-AKT蛋白表达增加,说明PDGF-BB可以激活巨核细胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信号通路,促进巨核细胞增殖并抑制其凋亡。为了进一步证明PDGF-BB通过PDGFR作用于巨核细胞,加入PDGFR阻断剂伊马替尼,发现伊马替尼可以使PDGF-BB对巨核细胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信号通路的作用减弱。研究结论本研究发现ET患者骨髓中PDGF-BB、PDGFR-β表达显著升高；且升高的PDGF-BB能有效升高小鼠外周血血小板数目,而伊马替尼可以有效得阻断该作用；PDGF-BB能促进巨核细胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信号通路的激活,而伊马替尼能有效阻断PDGF-BB对巨核细胞信号通路的活化作用。因此,我们推断ET患者骨髓中升高的PDGF-BB和PDGFR-β通过激活巨核细胞JAK2/STAT3、 PI3K/AKT信号通路的活化,促进巨核细胞增殖,并抑制其凋亡,进而促进血小板的生成和释放,可能是ET发病的机制之一；酪氨酸激酶抑制剂,伊马替尼通过作用于PDGFR,有效阻断PDGF-BB对巨核细胞JAK2/STAT3、PI3K/AKT信号通路的促活化作用,从而抑制PDGF-BB对巨核细胞／血小板的促生成作用,可能对ET有治疗作用。