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鱼类诺卡氏菌病（Fish nocardiosis）是一种由诺卡氏菌引起的、发生在多种经济养殖鱼类的慢性感染病。近年来鱼类诺卡氏菌病的流行,给养殖户带来极大困扰。该病的病原菌可以通过鱼体的伤口或鱼鳃以及食物饲料等进行感染,感染鱼类诺卡氏菌病的杂交鳢（Channa maculate♀×Channa argus♂）早期无明显病症,病情隐性缓慢发展,一旦感染后期治疗困难,病死率高。典型的疾病特征包括肾脏、脾脏、心脏、鳃和肝脏出现肉芽肿结节,伴有多发性皮肤溃疡。鱼类诺卡氏菌病的致病菌主要有三种,其中鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolae）近年来的感染案例最多。该菌是一种机会致病菌,容易使免疫力低下的鱼类患病。鰤鱼诺卡氏菌感染已在40多种鱼类中报道,其所引起的鱼类诺卡氏菌病日益严重,给全球的淡水和海洋养殖系统造成越来越严重的损害。本研究利用17株鰤鱼诺卡氏菌的全基因组序列信息,筛选获得特异性片段ORF3659,并设计特异性引物659-F/R,建立鰤鱼诺卡氏菌特异性PCR检测方法。同时本研究应用体内诱生抗原技术,筛选鉴定鰤鱼诺卡氏菌的体内诱导基因,利用体内诱导基因制备DNA疫苗并免疫杂交鳢后进行免疫效果评估,以期实现鱼类诺卡氏菌病的免疫预防。本研究的详细结果如下:1、本研究以鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503株基因组序列信息为模板,通过比较多株鰤鱼诺卡氏菌基因组序列,发现一序列片段ORF3659存在鰤鱼诺卡氏菌种内保守、其他诺卡氏菌种间特异的特点,并设计一对659-F/R引物。利用该对引物建立鰤鱼诺卡氏菌特异性PCR检测方法。条件优化后的PCR反应最佳退火温度为64℃,仅在鰤鱼诺卡氏菌中能特异性扩增目的片段,并且能快速、准确、灵敏地检测出隐性感染诺卡氏菌的鱼苗,PCR检出的最低核酸浓度为80 pg/μL,检出的最低菌液浓度为8.6 CFU/μL。2、本研究利用体内诱生抗原技术鉴定鰤鱼诺卡氏菌的体内诱导基因:提取鰤鱼诺卡氏菌的DNA,使用大肠杆菌工程菌构建鰤鱼诺卡氏菌基因组表达文库,收集鰤鱼诺卡氏菌感染后的杂交鳢血清,并用从培养基收集的鰤鱼诺卡氏菌全菌及其超声破碎处理后的菌体裂解物、和不含基因组文库的大肠杆菌超声破碎处理后的裂解物充分吸收处理血清,通过免疫杂交的方法共筛选出六个鰤鱼诺卡氏菌的体内诱导基因:IS701 family transposase、molybdopterin-dependent oxidoreductase、Yid C、phosphoketolase family protein、Egt A和hypothetical protein6747。3、本研究对六个体内诱导基因进行生物信息学分析,并分别将六个体内诱导基因插入真核表达载体pc DNA3.1-myc-his-A和原核表达载体p ET28a,成功构建六种真核表达载体和六种原核表达载体,大量提取六种去内毒素真核表达重组质粒,制备成DNA疫苗。4、DNA疫苗免疫保护效果评估。本研究应用六种DNA疫苗腹腔注射免疫杂交鳢35 d,分别收集0、7、14、21、28和35 d的血清和肌肉、头肾、脾脏和肝脏四个组织,在注射重组表达质粒的第7、28 d对各实验组的的肌肉、肝脏、脾脏与体肾组织进行RT-PCR检测,电泳检测均能发现与扩增产物片段大小相符的目的条带,表明六个体内诱导基因在杂交鳢体内获得表达。用四种血清酶活检测试剂盒分别检测杂交鳢血清中的非特异性免疫指标:LZM溶菌酶活力指标、SOD超氧化物歧化酶活力指标、ACP酸性磷酸酶活力指标和AKP碱性磷酸酶活力指标。检测结果显示,与pc DNA组和PBS组两组对照组比较,在不同的疫苗免疫时间点,各实验组中四种非特异性血清检测指标均有明显上升,并在不同疫苗免疫时间点达到指标检测峰,表明六种DNA疫苗能够提高杂交鳢血清中非特异性免疫指标。通过间接ELISA实验检测六种DNA疫苗注射鱼体后体内血清抗体效价。检测结果显示,与pc DNA组和PBS组两组血清对照组比较,实验组中7 d后的抗体水平均有明显上升,并在不同疫苗免疫时间点达到抗体水平检测的峰值,说明六种疫苗都可引起杂交鳢的特异性免疫应答。利用q RT-PCR检测鱼体内四个组织中六个免疫相关基因（CD4、CD8α、MHCIIα、TNFα、IL-1β和MHCIα）在0、7、14、21、28和35 d的m RNA表达水平。结果表明,DNA疫苗免疫后杂交鳢四个组织中六个免疫相关基因的m RNA表达水平分别在不同时间段极显著上升并达到峰值。计算六种DNA疫苗的免疫保护率,实验结果显示,六种DNA疫苗,其相对免疫保护率（RPS）分别为IS701 family transposase组:45.06%;molybdopterin-dependent oxidoreductase组:61.04%;Yid C组:65.36%;phosphoketolase family protein组:53.82%;Egt A组:61.04%;hypothetical protein6747组:43.73%。