内膜增生是血管受损后普遍出现的病理现象,是导致动脉粥样硬化的重要环节,同时也是搭桥手术、冠脉内支架术后血管再狭窄的重要原因。具体来说,内膜增生是血管内膜的增厚。正常情况下,血管内膜主要成分仅为内皮细胞及内皮下层;其中内皮下层仅含有少量胶原纤维、弹性纤维,有时有少许平滑肌细胞。内膜增生机制复杂,内皮细胞受损,平滑肌细胞增殖迁移,细胞外基质降解和重新合成,脂质沉积和炎症反应都参与到该过程中。目前,抑制和治疗内膜增生的方法有限,研究其机制和病理过程将有利于找到有效的治疗方法。Tiam1属于鸟嘌呤核苷酸转换因子(GEF)家族,主要是小G蛋白Rac1的调节蛋白,激活Rac1的信号通路。Tiam1参与成纤维细胞、神经细胞、肿瘤细胞的细胞骨架重排、细胞迁移、内吞和增殖等过程。PDGF能激活细胞内Tiam1。另外,已有研究发现不表达ephrin-B2的小鼠其Tiam1-Rac1信号通路活性下降,伴有血管壁缺损和动脉瘤的形成。说明Tiam1对血管的结构可能有重要作用,但是目前尚没有研究发表关于Tiam1与平滑肌细胞及内膜增生之间的直接关系。我们的研究通过不表达Tiam1蛋白的小鼠单侧颈内动脉结扎模型,显示Tiam1敲除能减少动脉内膜增生,并且揭示其相关的具体机制。本论文主要研究内容包括以下几个方面:1.Tiam1在平滑肌细胞中的表达(i)目的:探讨Tiam1在血管平滑肌细胞中的表达(ii)方法:原代培养大鼠血管平滑肌细胞,分为siCtl组、siCtrl+PDGF(20ng/ml)组、siTiam1组、siTiam1+PDGF(20ng/ml)组,在PDGF刺激0、12、24h后,免疫印迹方法分析Tiam1蛋白表达变化。(iii)结果sictrl组的vsmc会表达tiam1,在sictrl+pdgf组,tiam1的表达量增高,与sictrl组相比,sitiam1组tiam1的表达量明显减少甚至消失。加入pdgf刺激12及24h后,tiam1表达量明显增加。(iv)结论血管平滑肌细胞中表达tiam1蛋白。并且pdgf刺激后能促进tiam1的表达。2.tiam1对血管平滑肌细胞迁移的影响(ⅰ)目的:探讨tiam1对血管平滑肌细胞迁移功能的影响。(ⅱ)方法:原代培养大鼠血管平滑肌细胞,分四组进行转染:sictr组、sictr+pdgf(20ng/ml)组、sitiam1组、sitiam1+pdgf(20ng/ml)组。对四组细胞分别进行划痕实验,观察平滑肌细胞迁移功能的改变。(ⅲ)结果:细胞划痕实验中sitiam1组在12小时划痕迁移面积比例均小于sictr组(p<0.05)。但是24小时及加入pdgf刺激以后,sictrl组和sitiam1敲除组未见明显差异。(ⅳ)结论:tiam1缺乏能够在一定程度和一定时间内抑制平滑肌细胞的迁移能力。3.tiam1对平滑肌细胞增殖与凋亡功能的影响(i)目的探讨tiam1对平滑肌细胞增殖与凋亡的影响(ii)方法原代培养大鼠主动脉平滑肌细胞,分为阴性对照组,转染组,其中转染组分为sictrl组及sitiam1组,两组转染组当中分别又分为予以饥饿液(0.4%fbs培养基)组及完全培养基组(20%fbs培养基)。予以annexin-fitc/pi染色流式细胞仪技术检测细胞凋亡,edu染色检测细胞增殖。(iii)结果(a)流式细胞仪技术检测示,sictrl组及sitiam1组均存在大量晚期凋亡细胞,两者无明显差异。(b)edu染色显示,sitiam1组与sictrl组相比,edu阳性细胞数量明显减少。(iv)结论tiam1缺乏抑制能明显抑制平滑肌细胞的增殖能力,对凋亡无明显作用。4.tiam1在血管平滑肌细胞中对pi3k/akt、mapk/p38信号通路的影响(i)目的探讨tiam1在血管平滑肌细胞中对pi3k/akt、mapk/p38通路的影响(ii)方法原代培养大鼠血管平滑肌细胞,分2组,分别转染sictrl及sitiam1,每组中分6小组,转然后分别加pdgf刺激0、5、15、30、60、90分钟。提取细胞蛋白,免疫印迹法分析p-akt、p-p38变化水平。(ⅲ)结果:westernblotting结果显示:1)sitiam1+pdgf(30min)组、sitiam1+pdgf(60min)组和sitiam1+pdgf(90min)组中p-akt的表达较sictr+pdgf(30min)组、sictr+pdgf(60min)组和sictr+pdgf(90min)明显减少(p<0.05);2)sitiam1+pdgf(5min)组、sitiam1+pdgf(15min)组中p-p38的表达较sictr+pdgf(5min)组、sictr+pdgf(15min)组明显减少(p<0.05)。(ⅳ)结论:tiam1可能通过pi3k/akt、mapk/p38信号通路的转导参与内膜增生的形成。5.tiam1对血管损伤后内膜增生的影响(ⅰ)目的:探讨tiam1对血管损伤后内膜增生的影响。(ⅱ)方法:(a)利用pcr、核酸电泳、基因测序对tiam1小鼠进行基因分型筛选出wt小鼠和ko小鼠,对其进行分组。(b)wt组和ko组小鼠各5只,行左侧颈动脉结扎术,术后24天取双侧颈动脉,对血管进行石蜡切片。对wtligated组、wtsham组koligated组、kosham组颈动脉进行he染色,观察及测量内膜(i)、中膜面积(m)及外膜面积(adv),计算i/m比值,并对其进行统计学比较。(ⅲ)结果:(a)根据基因测序图分析,发生双突变的为KO,单突变为杂合子,未发生突变为WT(b)HE染色结果显示,颈动脉结扎24天后,小鼠手术侧颈动脉内膜明显增厚,KO ligated组内膜面积明显小于WT ligated组内膜面积(P<0.05);KO ligated组I/M比值明显小于WT ligated组(P<0.05);KO ligated组和WT ligated组中膜及外膜面积无明显差异。(ⅳ)结论:Tiam1敲除会减少颈动脉内膜增生。