合成生物学旨在理性设计和构建新的生物系统,为实现这一目标,开发高质量的标准化生物元件和建立快捷高效的基因编辑系统是合成生物学发展的重要基础。枯草芽孢杆菌启动子文库的构建与应用。基于野生型Bacillus subtilis 168转录组数据分析,设计启动子结构,采用随机突变非保守区的方法,以gfp为报告基因,共筛选5000株样本的启动子文库,文库强度为P43启动子强度的2%-94%,经文库启动子串联构建强启动子TP2,强度达到P43启动子的2.77倍。对启动子强度梯度连续分布的214条启动子进行测序和分析,启动子强度在转录和翻译水平具有很好的相关性。通过多元统计学和最小二乘法分析拟合文库,得到强弱启动子序列结构的规律和文库的线性回归曲线,开发了基于“位点-碱基”分布规律的启动子理性重构方法,重构启动子Pm强度达到P43启动子的1.2倍。将此基于统计概率分布的分析方法拓展到谷氨酸棒杆菌的启动子文库构建,最终重构文库的平均强度比初始文库提高了39%。最终,将枯草芽孢杆菌启动子文库应用于肌苷和乙偶姻代谢途径的基因弱化和过表达。利用文库对嘌呤途径pur A基因启动子进行不同梯度的弱化,使出发菌株的肌苷产量提高了7倍。利用TP2启动子过表达木聚糖酶,使出发菌株可在木聚糖为唯一碳源的基本盐培养基中生长且生产乙偶姻,产量与P43对照菌株相比提升了44%。枯草芽孢杆菌CRISPR/Cas9n多重基因组编辑技术的开发与应用。构建了迭代、可循环的CRISPR/Cas9n多重基因组编辑系统,优化了质粒消除系统及gRNA与donor DNA的一步组装流程,可实现3天一个编辑循环的高效、快捷的基因编辑操作。在此系统作用下单位点突变效率接近100%,小片段插入和删除(1-6 kb片段敲除和1-2 kb片段插入)效率达到90%以上,8 kb片段敲除效率可达82%,20.5 kb大片段删除效率达23.6%。基于Cas9n的活性特点,该系统在多位点编辑效率方面具有明显优势。双位点突变效率高于90%,三位点突变效率达到49%。基于ligD基因调控胞内单链DNA切口修复系统,最终该系统的三位点同时编辑效率达到65%。利用CRISPR/Cas9n多重基因组编辑系统优化枯草芽孢杆菌核黄素操纵子,通过组合优化策略同时修饰三个基因的RBS序列,经过一轮筛选,获得的最优菌株核黄素产量比出发菌株提高59%。对RBS区域次级结构的模拟可得出在高产菌株中ribA基因表达强度提升,ribB基因表达强度下降的变化趋势,为解释核黄素代谢机理提供理论支持。