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中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是本实验室分离鉴定并且命名的一种由禾谷多黏菌传播的双组分单链正义RNA杆状植物病毒,它是真菌传杆状病毒属(Furovirus)的一个新成员。位于CWMV RNAl的3’末端的ORF 3编码一个约37 kDa的运动蛋白。运动蛋白在介导植物病毒细胞到细胞的运动过程中发挥重要作用,因此,原核表达此蛋白,制备其特异性抗血清,并应用酵母双杂交系统筛选与其相互作用的宿主蛋白,有助于阐明CWMV在宿主细胞间运动的分子机制。 本研究根据Diao等(1999)发表的CWMV的RNAl全序列设计特异性表达引物,应用RT-PCR技术从小麦病叶中扩增得到长约1 kb的DNA片段。将其克隆至载体pGEM-T,序列分析表明成功获得全长MP基因。开放阅读框架包括990个核苷酸,编码329个氨基酸,与已报道的CWMV基因组相应核苷酸序列(EMBL登录号:AJ012005)同源性为99.6%。将MP基因亚克隆至原核表达载体构建重组质粒pSBET-MP,SDS-PAGE分析表明,转有pSBET-MP的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS高效表37 kDa蛋白,与MP基因阅读框架的理论推算值37.4kDa相符。并以含表达产物的凝胶为抗原,按常规方法免疫小鼠,免疫三次后第三天断头收集血清。Western blot分析表明制得的抗血清是针对MP的多抗,并且具有很强的专一性。ELISA测定其效价约为1:1200。 用Trizol提取小麦总RNA后并将其纯化成mRNA,应用SMART技术合成第一链cDNA。然后用5’和3’PCR引物进行LD-PCR扩增,合成双链cDNA,并与pGADT7-Rec一起转化酵母菌AH 109,构建小麦的酵母双杂交cDNA文库。经检测,所构文库的独立克隆数为2.3x10~6,文库滴度为8.6x10~8cfu/ml,50%的文库质粒插入片段大于500 bp,可以用于文库筛选。 将MP基因重组到质粒pGBKT7中,构建酵母双杂交载体pGBKT7-MP,电击转入酵母菌Y187。Western blot分析表明MP基因在酵母体内能正确表达具有免疫活性的融合蛋白,并排除对宿主细胞的毒害和自激活作用,可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”质粒。 利用酵母菌Y187(MATa型)和AHl09(MATa型)能融合形成二倍体细胞的原理,将Y187/pGBKT7-MP与小麦cDNA文库菌AHl09接合,通过营养缺陷培养和x-α-gal活性分析方法筛选与MP相互作用的阳性候选克隆。Lyticase法抽提阳性候选克隆的质粒,PCR检测文库质粒中插入片段大小。取插入片段大于500 bp的文库质粒转化大肠杆菌TGl,提取质粒后通过回转实验进一步排除假阳性。最终对确定的13个阳性克隆的插入片段进行DNA测序,测序结果提交GenBank分析,发现共筛得五种蛋白可能与MP具有相互作用,分别是:交替氧化酶(alternative oxidase,AOX)、硫辛酸合酶类似蛋白(liDoic acid