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研究目的：四溴双酚A(TBBPA)是生活中普遍存在且使用量最大的溴代阻燃剂。TBBPA在水体中的浓度为10-100ng/L。通过大量文献调研我们发现，TBBPA对哺乳动物和硬骨鱼类具有发育、生殖和神经等方面的毒性效应，可引起机体神经损伤和运动行为的改变。二氧化钛纳米颗粒(TiO2NPs)是一种重要纳米材料，在水体中的浓度为0.7-1.6μg/L。通过文献调研我们发现，TiO2NPs可造成肺、肝、肾等脏器损伤，并可能对中枢神经系统造成损害。TiO2NPs与环境中化学物质的交互毒性作用正成为一个研究热点，其与环境优先污染物联合暴露的健康风险引起了越来越多的关注，例如已有TiO2NPs与双酚A(BPA)等环境中化学物质的交互毒性作用研究报道，而且低剂量的TiO2NPs可促进其他化合物的吸收、迁移和转化等作用。由于应用广泛，溴系阻燃剂和金属纳米颗粒往往共同存在于同一个产品中，例如TBBPA可作为催化剂，提高TiO2纳米管高效光催化氧化活性，且进入环境后两者也会相遇而产生交互作用。虽然已有研究表明TBBPA和TiO2NPs均具有发育神经等方面的毒性作用，但对两者联合暴露的风险认识还比较粗浅，其联合暴露的毒性效应的内在机制还较少。为了探究TBBPA和TiO2NPs联合暴露的神经毒性可能的机制，我们设计以下实验。
研究方法：我们通过大量的文献调研，并结合1)TBBPA或TiO2NPs单独暴露对斑马鱼的发育毒性效应，2)TBBPA和TiO2NPs联合暴露对斑马鱼的神经行为毒性效应，以及3)TBBPA和TiO2NPs联合暴露对斑马鱼的发育、氧化应激、凋亡和代谢机制三个实验层面来探讨联合暴露的神经行为毒性效应和机制。
研究结果：通过查阅大量文献并参考本实验室之前的研究成果，我们选择了1-6μM TBBPA以及0.01mg/L和0.1mg/L TiO2NPs单独暴露对斑马鱼的发育毒性进行研究，发现TBBPA单独暴露斑马鱼具有发育毒性，与对照组相比，单独暴露TBBPA浓度增加到4μM时120hpf斑马鱼的畸形率和死亡率均显著上升；斑马鱼单独暴露TBBPA120hpf的主要畸形表现为游囊未打开、尾部弯曲、脊柱弯曲、心包囊肿、卵黄囊肿；而低浓度的TiO2NPs单独暴露斑马鱼不具有发育毒性，单独暴露TiO2NPs浓度为0.01mg/L和0.1mg/L时120hpf斑马鱼的畸形率和死亡率均无显著影响。通过查阅大量文献并结合TBBPA单独暴露对斑马鱼的神经发育毒性的实验结果以及本实验室之前的研究成果，我们选择0.25μM和2.5μM的TBBPA和0.01mg/L和0.1mg/L的TiO2NPs进行斑马鱼发育和神经行为毒性实验，我们发现TBBPA和TiO2NPs联合暴露可引起斑马鱼神经行为毒性效应。斑马鱼光暗周期行为结果表明，0.25μM TBBPA单独暴露和TBBPA浓度为0.25μM的联合暴露对斑马鱼的昼夜节律、游泳能力和整体的运动活力均具有不同程度的影响。旷野行为结果表明，TBBPA和TiO2NPs单独暴露和联合暴露对斑马鱼的探索行为均具有不同程度的影响。集群行为结果表明，TBBPA单独暴露以及TBBPA和TiO2NPs联合暴露可影响斑马鱼获取鱼群中的信息，从而对斑马鱼产生神经行为毒性。镜面攻击行为结果表明，TiO2NPs单独暴露以及TBBPA和TiO2NPs联合暴露均可影响发育后期斑马鱼镜面攻击社会行为学，从而改变斑马鱼的攻击趋势和焦虑程度。社会交往行为结果表明，0.1mg/L TiO2NPs单独暴露组和TiO2NPs浓度为0.1mg/L的联合暴露组对发育后期斑马鱼社会交往行为具有显著降低作用。基于前两部分的实验结果以及本实验室之前的研究成果，我们选择2.5μM的TBBPA和0.01mg/L的TiO2NPs进行斑马鱼发育和神经行为毒性的机制研究。结果表明TBBPA和TiO2NPs联合暴露对斑马鱼发育相关的3个基因mmp9,nrxn2a，gap43的表达量均有影响，提示斑马鱼发育时期各处理组细胞外基质和胶原降解可能受到抑制。两个单独暴露组对斑马鱼运动神经元轴突发育相关基因具有显著影响，这两种化合物可能通过影响神经元轴突和神经连接蛋白相互作用从而改变突触结构，进而影响斑马鱼的神经发育。与斑马鱼氧化应激相关的3个基因sod1,cat，gpx1a的表达量变化结合H2DCFDA荧光染色实验结果说明，TBBPA和TiO2NPs单独和联合暴露均影响氧化应激反应，这两种化合物均可抑制超氧化物歧化酶的表达，TBBPA引起的氧化应激主要影响谷胱甘肽过氧化物酶，可能是机体以应对氧化应激反应的反馈机制。与斑马鱼凋亡相关的4个基因casp3a,casp8，bax和p53的表达量变化说明，48hpf时TBBPA可以通过影响斑马鱼体内p53-bax通路引起凋亡，联合暴露还影响斑马鱼体内casp8-bax通路进而通过线粒体途径引起凋亡，而120hpf时主要通过影响斑马鱼体内casp8-bax通路进而通过线粒体途径引起凋亡，AO和彗星实验的实验结果也进一步印证了该发现。与斑马鱼代谢相关的9个ugt基因家族的基因的表达量变化说明，ugt1a和ugt2a基因家族在48hpf及120hpf各处理组表达量均受到抑制而ugtb基因家族则增减不一，通过影响甲状腺素(T4)代谢，进而导致神经行为改变。荧光染色实验结果表明TBBPA暴露可能影响磷脂酶A2；短链脂肪酸；长链脂肪酸；以及胆固醇的合成。两种化合物联合暴露可能产生不同程度的协同和拮抗效应。主要的一级代谢酶Cyp1a仅48hpf时TBBPA单独暴露组显著增加，120hpf时均未明显改变。上述结果说明，这两种化合物的联合暴露主要影响二级代谢主要相关酶中的ugt基因家族的表达，而对一级代谢主要相关酶中的Cyp1a影响甚微。
研究结论：TBBPA单独暴露具有一定的发育毒性。TBBPA和TiO2NPs联合暴露可引起斑马鱼神经行为毒性效应。TBBPA和TiO2NPs联合暴露可能引起发育时期斑马鱼细胞外基质和胶原降解受到抑制。两个单独暴露组对斑马鱼运动神经元轴突发育具有显著影响，这两种化合物还可通过影响神经元轴突和神经连接蛋白相互作用从而改变突触结构，进而影响斑马鱼的神经发育。TBBPA和TiO2NPs单独和联合暴露中均影响氧化应激反应。TBBPA和TiO2NPs联合暴露可引起斑马鱼体内凋亡反应。TBBPA和TiO2NPs联合暴露主要影响二级代谢主要相关酶中的ugt基因家族的表达，而对一级代谢主要相关酶中的Cyp1a影响甚微。
研究方法：我们通过大量的文献调研，并结合1)TBBPA或TiO2NPs单独暴露对斑马鱼的发育毒性效应，2)TBBPA和TiO2NPs联合暴露对斑马鱼的神经行为毒性效应，以及3)TBBPA和TiO2NPs联合暴露对斑马鱼的发育、氧化应激、凋亡和代谢机制三个实验层面来探讨联合暴露的神经行为毒性效应和机制。
研究结果：通过查阅大量文献并参考本实验室之前的研究成果，我们选择了1-6μM TBBPA以及0.01mg/L和0.1mg/L TiO2NPs单独暴露对斑马鱼的发育毒性进行研究，发现TBBPA单独暴露斑马鱼具有发育毒性，与对照组相比，单独暴露TBBPA浓度增加到4μM时120hpf斑马鱼的畸形率和死亡率均显著上升；斑马鱼单独暴露TBBPA120hpf的主要畸形表现为游囊未打开、尾部弯曲、脊柱弯曲、心包囊肿、卵黄囊肿；而低浓度的TiO2NPs单独暴露斑马鱼不具有发育毒性，单独暴露TiO2NPs浓度为0.01mg/L和0.1mg/L时120hpf斑马鱼的畸形率和死亡率均无显著影响。通过查阅大量文献并结合TBBPA单独暴露对斑马鱼的神经发育毒性的实验结果以及本实验室之前的研究成果，我们选择0.25μM和2.5μM的TBBPA和0.01mg/L和0.1mg/L的TiO2NPs进行斑马鱼发育和神经行为毒性实验，我们发现TBBPA和TiO2NPs联合暴露可引起斑马鱼神经行为毒性效应。斑马鱼光暗周期行为结果表明，0.25μM TBBPA单独暴露和TBBPA浓度为0.25μM的联合暴露对斑马鱼的昼夜节律、游泳能力和整体的运动活力均具有不同程度的影响。旷野行为结果表明，TBBPA和TiO2NPs单独暴露和联合暴露对斑马鱼的探索行为均具有不同程度的影响。集群行为结果表明，TBBPA单独暴露以及TBBPA和TiO2NPs联合暴露可影响斑马鱼获取鱼群中的信息，从而对斑马鱼产生神经行为毒性。镜面攻击行为结果表明，TiO2NPs单独暴露以及TBBPA和TiO2NPs联合暴露均可影响发育后期斑马鱼镜面攻击社会行为学，从而改变斑马鱼的攻击趋势和焦虑程度。社会交往行为结果表明，0.1mg/L TiO2NPs单独暴露组和TiO2NPs浓度为0.1mg/L的联合暴露组对发育后期斑马鱼社会交往行为具有显著降低作用。基于前两部分的实验结果以及本实验室之前的研究成果，我们选择2.5μM的TBBPA和0.01mg/L的TiO2NPs进行斑马鱼发育和神经行为毒性的机制研究。结果表明TBBPA和TiO2NPs联合暴露对斑马鱼发育相关的3个基因mmp9,nrxn2a，gap43的表达量均有影响，提示斑马鱼发育时期各处理组细胞外基质和胶原降解可能受到抑制。两个单独暴露组对斑马鱼运动神经元轴突发育相关基因具有显著影响，这两种化合物可能通过影响神经元轴突和神经连接蛋白相互作用从而改变突触结构，进而影响斑马鱼的神经发育。与斑马鱼氧化应激相关的3个基因sod1,cat，gpx1a的表达量变化结合H2DCFDA荧光染色实验结果说明，TBBPA和TiO2NPs单独和联合暴露均影响氧化应激反应，这两种化合物均可抑制超氧化物歧化酶的表达，TBBPA引起的氧化应激主要影响谷胱甘肽过氧化物酶，可能是机体以应对氧化应激反应的反馈机制。与斑马鱼凋亡相关的4个基因casp3a,casp8，bax和p53的表达量变化说明，48hpf时TBBPA可以通过影响斑马鱼体内p53-bax通路引起凋亡，联合暴露还影响斑马鱼体内casp8-bax通路进而通过线粒体途径引起凋亡，而120hpf时主要通过影响斑马鱼体内casp8-bax通路进而通过线粒体途径引起凋亡，AO和彗星实验的实验结果也进一步印证了该发现。与斑马鱼代谢相关的9个ugt基因家族的基因的表达量变化说明，ugt1a和ugt2a基因家族在48hpf及120hpf各处理组表达量均受到抑制而ugtb基因家族则增减不一，通过影响甲状腺素(T4)代谢，进而导致神经行为改变。荧光染色实验结果表明TBBPA暴露可能影响磷脂酶A2；短链脂肪酸；长链脂肪酸；以及胆固醇的合成。两种化合物联合暴露可能产生不同程度的协同和拮抗效应。主要的一级代谢酶Cyp1a仅48hpf时TBBPA单独暴露组显著增加，120hpf时均未明显改变。上述结果说明，这两种化合物的联合暴露主要影响二级代谢主要相关酶中的ugt基因家族的表达，而对一级代谢主要相关酶中的Cyp1a影响甚微。
研究结论：TBBPA单独暴露具有一定的发育毒性。TBBPA和TiO2NPs联合暴露可引起斑马鱼神经行为毒性效应。TBBPA和TiO2NPs联合暴露可能引起发育时期斑马鱼细胞外基质和胶原降解受到抑制。两个单独暴露组对斑马鱼运动神经元轴突发育具有显著影响，这两种化合物还可通过影响神经元轴突和神经连接蛋白相互作用从而改变突触结构，进而影响斑马鱼的神经发育。TBBPA和TiO2NPs单独和联合暴露中均影响氧化应激反应。TBBPA和TiO2NPs联合暴露可引起斑马鱼体内凋亡反应。TBBPA和TiO2NPs联合暴露主要影响二级代谢主要相关酶中的ugt基因家族的表达，而对一级代谢主要相关酶中的Cyp1a影响甚微。