化学农药和化肥的过度使用已经对环境和食品安全构成严重威胁。开发利用环境友好的有益微生物进行植物病害生物防治作为化学防治的替代或补充,有利于农业可持续发展、维护生态平衡和保障食品安全性。但是生防微生物也存在抗菌谱狭窄、生防活性不稳定等缺点。因此筛选新的靶标基因构建具有高效和稳定生防活性的工程菌株具有重要的理论价值和应用前景。GGDEF/EAL结构域蛋白在细菌中广泛存在,大量研究已表明它们参与调控细菌运动性、生物膜形成、致病性、细胞分化和增殖等多种生命活动。然而,在植病生防菌中GGDEF/EAL结构域蛋白的相关研究至今尚未见报道。普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica) G3是分离自小麦内茎的内生菌,能够产生多种抗真菌因子如蛋白酶、几丁质酶、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin, PRN),以及植物促生物质吲哚乙酸IAA与乙偶姻,因而具有一定的生防和促生潜能。前期研究已表明QS系统、Rsm系统、Hfq和RpoS等全局调控因子参与调控G3菌株的生防活性。通过分析S. plymuthica G3基因组序列鉴定了一个编码GGDEF/EAL结构域蛋白质的基因pigX,但是功能未知。本研究以S. plymuthica G3为模式菌鉴定pigX基因的生物学功能。首先通过构建突变体和表型分析等策略,初步鉴定了PigX调控的生防相关表型；然后利用lux和lacZ报告基因分别构建转录和翻译融合,分析了PigX调控运动性和PRN合成等的分子机制,以及与QS系统、 Rsm系统、Hfq和RpoS之间的相互作用及自我调控机制；最后利用比较蛋白质组学解析pigX突变对稳定期全细胞蛋白表达谱的影响,以期更好地了解PigX在G3菌株中的生物学功能。PigX生物学功能的研究不仅可以进一步了解G3菌株生防活性的调控网络,也为更好地改良G3菌株的生防活性提供理论依据。主要研究结果如下：(1)利用基因替换、同源重组策略构建了pigX突变体pigX::Gm;通过比较野生型G3和pigX::Gm突变体蛋白酶与几丁质酶活性、运动性、生物膜形成和抗真菌活性,发现PigX正调控蛋白酶、几丁质酶活性,以及运动性和抗真菌活性,负调控生物膜形成。通过检测细菌提取物中PRN及培养物中的IAA和乙偶姻,发现PigX正调控PRN产生,负调控IAA和乙偶姻的合成。以上研究结果表明PigX作为G3菌株多效调控子在调节内生菌S. plymuthica与寄主植物有益互作中发挥重要作用。(2)利用lux和lacZ报告基因分别构建转录和翻译融合,分析了PigX调控运动性、PRN合成的分子机制。结果表明PigX正调控鞭毛主调控子操纵子flhDC和PRN合成基因簇prnABCD的转录和翻译,这暗示了PigX可能通过影响flhDC的表达调控运动性,通过增强prnABCD的表达而正调控PRN的合成。(3)基于-lux和acZ的转录和翻译融合分析表明PigX与其它全局调控系统(子)之间存在密切的互作：A)PigX正调控AHLs合成酶spll和spsl的转录,所以可能通过影响AHLs的合成,进而影响QS系统；B)PigX在稳定期负调控rsmB的转录,正调控rsmA的转录,而RsmB和RsmC则正调控pigX的转录和翻译；C)PigX自我正调控；D)PigX正调控hfq的转录,同时Hfq正调控pigX的转录和翻译；E)RpoS负调控pigX的转录和翻译。(4)运用比较蛋白组学策略鉴定了PigX在翻译水平调控的靶蛋白,揭示了野生型G3和pigX::Gm突变体在稳定期(24h)蛋白表达谱的差异。MALDI-TOF/TOF MS共鉴定出了133个差异表达的蛋白点,代表着128种蛋白。与野生型G3相比,pigX::Gm突变体中79个点蛋白丰度上升,54个下降。GO和COG功能分析表明这些蛋白参与多个生物学过程,包括能量产生与转化,氨基酸、碳水化合物、核酸、脂、无机物盐的代谢和转运,蛋白质折叠,氧化胁迫,细胞包被和外膜结构、细胞运动性及信号转导等。在鉴定的差异蛋白点中,有15个参与碳水化合物的代谢和转运,17个与胁迫反应相关,6个为外膜通道蛋白。进一步KEGG pathway分析显示,多个蛋白参与糖酵解、糖异生和TCA循环等代谢途径。其中重要差异蛋白点描述如下：A)pigX突变影响外膜结构,导致外膜通道蛋白OmpA、OmpC和TolC表达量下降,这可能影响细菌分泌物质的转运。B)饥饿/稳定期保护蛋白Dps、超氧岐化酶SOD、过氧化氢酶CAT和通用应激蛋白UspE在pigX::Gm突变体中的表达水平较野生菌都明显下降。表型分析证实了PigX正调控SOD和CAT活性,因而可能增加细菌对氧胁迫的耐受性,暗示PigX可能影响细菌的生态适应性。C)鞭毛蛋白在野生型G3中特异表达,而flhDC转录抑制子LrhA在pigX::Gm突变体中高表达。SDS-PAGE和质谱鉴定证实了PigX正调控鞭毛蛋白产生,基于-lacZ的翻译融合分析也验证了PigX负调控LrhA,正调控FlhDC 。以上实验结果表明PigX可能至少部分通过影响鞭毛主调控子FlhDC及其转录抑制子LrhA的表达激活鞭毛蛋白产生,从而正调控细菌鞭毛依赖的运动性。综上所述,PigX通过与转录调控系统QS和转录后Rsm系统、以及Hfq和RpoS等全局调控子互作整合进入复杂的调控网络,在G3菌株中在多个水平全局调控细菌的各种生理活动和行为,包括细菌分泌抗生素PRN、植物生长素IAA和乙偶姻,进而影响细菌的生防活性和植物生长促进潜能,以及氧化应激、运动性和生物膜形成等生态适应性。