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苏铁类植物Cycads是介于蕨类和种子植物之间的过渡类型,属于最原始的种子植物,也是最重要的珍稀濒危植物之一,需重点给予保护。保护苏铁类植物的一个重要的任务是对雌雄植株进行合理地搭配栽培,以便其能够顺利进行授粉,繁殖。但目前对于苏铁性别的研究比较匮乏,已有研究证实雌雄异株的植物其性别差异可以在转录组中得到充分反映,然而对于苏铁类植物雌、雄株转录组方面的研究还是空白,因此本文基于以前的研究,选用越南篦齿苏铁Cycas elongata(Leandri)D.Y.Wang的雌、雄株叶片,大、小孢子叶片为研究材料,分别对其进行转录组测序,对测序结果进行分析研究,以增加苏铁属植物的分子生物学资料,并为苏铁类植物的性别研究提供进一步的分子证据。
本研究选用越南篦齿苏铁(Cycas elongata)的雌株叶片、雄株叶片、大孢子叶片和小孢子叶片为研究材料,应用新一代高通量Solexa双向测序法对这四种材料进行双向测序,选用测序片段为75bp的读取长度,然后将得到的原始数据进行聚类组装分析。研究结果如下:
1.共得到雌株叶片表达序列106,891(41,802cluster,65,089Singletons)条,雄株叶片表达序列110,826(41,794cluster,69,032Singletons)条,大孢子叶片表达序列110,261(956cluster,109,305Singletons)条,小孢子叶片表达序列87,762(515cluster,87,247Singletons)条。
2.将雄株叶片与雌株叶片设定为一组、大孢子叶片与小孢子叶片设定为另一组,对苏铁雌、雄植株叶片,大、小孢子叶片的转录组进行表达基因的差异分析,通过分析找到了大量不同样本之间具有差异性的表达基因。发现在苏铁雌、雄植株中不仅大、小孢子叶片的表达基因存在显著差异(具有差异性的表达基因占大、小孢子叶片总表达基因的45％),而且在雌、雄植株的叶片中也有大量的表达基因具有显著差异(雌、雄植株的叶片之间具有显著差异性的表达基因占叶片总表达基因的25%),这些具有差异性的表达基因多是同一基因在不同性别的同一部分中表达的部位存在差异,同时也存在单独在雌株叶片(1,020条,RPKM=0)、雄株叶片(1,337条,RPKM=0)、大孢子叶片(17,449条,RPKM=0)和小孢子叶片(3,081条,RPKM=0)中表达的基因。
3.应用BLASTX,将我们测得的数据与KEGG,COG数据库中的所有数据进行比对,通过数据库中已有核酸序列和蛋白质序列,对得到的所有数据进行功能注释和功能分类。
4.应用表达基因功能的注释找到了与DNA甲基化、激素和挥发气体相关的表达基因。应用TBLASTX对雌雄株间的表达序列进行比对,相似度E-value小于1E-10时,得到了雌株具有的特有序列37对表达序列,和雄株特有序列69对表达序列。并对这些序列进行功能注释,得到了某些序列的相似基因的表达通路。