血管并发症是糖尿病(DM)的重要并发症,严重影响了糖尿病患者的生活质量,给患者及社会带来了沉重的负担,而且是糖尿病死亡的主要原因。血管内皮细胞(endothelialeells,Ecs)是血液与血管平滑肌之间的生理屏障,其结构和功能的完整对维持正常血液循环具有十分重要的意义。Ecs功能障碍会导致糖尿病血管并发症的发生。　　 内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是来源于骨髓,在某些刺激下动员进入外周血,分化为成熟的内皮细胞,特定地归巢于缺血部位,参与新生血管的发生,所以EPCs在维持血管平衡及代偿性血管发生中必不可少。研究表明EPCs功能障碍是糖尿病血管并发症发生发展的重要原因。心血管危险因素如性别、年龄、吸烟、高血压、高脂血症、DM、肥胖和家族史等可影响EPCs的数量及功能。　　 目前,很多学者认为线粒体氧化应激激活了亚细胞损伤途径,是糖尿病及其血管并发症发生、发展的基础。　　 很多研究表明,Ecs功能异常发生于糖尿病发生之前。而糖尿病患者一级亲属(first degree relat ives,FDRs)及肥胖者是糖尿病的高危发病人群,我们推测,在这部分人群存在脂肪因子分泌异常、EPCs的改变及氧化应激。　　 本课题通过检测糖耐量正常的2型糖尿病患者一级亲属以及肥胖者的血管内皮功能、颈动脉内中膜厚度、外周血EPCs数量,研究氧化应激对EPCs水平的影响,探讨糖尿病高危人群外周血EPCs改变的影响因素;研究营养性肥胖大鼠骨髓源EPCs的改变及其抗氧化酶的表达以及氧化应激水平,同时应用高浓度葡萄糖对大鼠骨髓源EPCs进行培养,诱发氧化应激,并使用α硫辛酸(Alpha lipoic acid,ALA)进行干预,观察EPCs抗氧化酶的表达及功能的改变,探讨糖尿病血管并发症的发病机制及治疗措施,为预防及治疗糖尿病血管并发症的发生发展提供依据。　　 第一部分糖尿病高危人群血管内皮功能、内皮祖细胞水平与氧化应激　　 目的:探讨糖耐量正常T2DM一级亲属及肥胖者氧化应激与血管内皮功能及循环内皮祖细胞水平的关系。　　 方法:选择32例T2DM,男18例,女14例,平均年龄(44.78±1.82)岁;FDRs30例男16例,女14例,平均年龄(46.87±1.91)岁,经糖耐量试验空腹及餐后2h血糖于正常范围;肥胖组(oB)(BMI≧25kg/m2)31例,男16例,女15例,平均年龄(45.01±1.04)岁;正常对照组(NC)30例,男17例,女13例,年龄44.07±1.89岁。每组均检测身高、体重、血压、腰围、臀围,计算体重指数,测定空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、胰岛素(FINs),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。用流式细胞仪测定EPCs数量,多普勒超声仪测定内皮依赖性舒张功能(FMD)及颈动脉内中膜厚度(CCA-IMT);化学比色法测定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)及总抗氧化能力(TAO-C)。所有计量资料用均数±标准差((x)±s)表示,对所测定结果进行正态性及方差齐性检验,多组间比较采用单因素方差分析。变量相关关系采用直线相关分析和多元直线回归分析。　　 结论:1.在2型糖尿病患者、2型糖尿病糖耐量正常一级亲属、肥胖者已经存在胰岛素抵抗、氧化应激、循环内皮祖细胞数量减少、血管内皮功能受损及动脉硬化。2.氧化应激是内皮祖细胞数量减少、血管内皮功能受损及动脉硬化的影响因素。3.在糖耐量正常2型糖尿病一级亲属,氧化应激与胰岛素抵抗可能是糖尿病及其血管并发症的始发因素。　　 第二部分营养性肥胖大鼠氧化应激与骨髓内皮祖细胞水平的研究　　 目的:应用高脂饲料喂养建立营养性肥胖大鼠模型,分离培养并对骨髓EPCs进行计数,同时测定肥胖大鼠血清氧化应激水平,来进一步探讨高脂饮食对大鼠骨髓源EPCs数量及功能改变并分析氧化应激对它的影响。　　 方法:1.清洁级健康雄性Wistar大鼠(体重200-250 g)23只,适应性喂养1周后,随机分为正常对照组(normal control group,NC)13只,高脂饮食组(high-fat-fed group,HF)10只。NC给予基础饲料(热量组成:碳水化合物占65.5％,脂肪占10.3％,蛋白质占24.2％),总热量为348kcal/100g;HF组喂以高脂饲料(热量组成为脂肪60％,碳水化合物20％,蛋白质20％),总热量为502 kcal/100g。16周后测定Lee's指数、体重,判断造模是否成功。2.造模成功后所有大鼠禁食10小时后均采用颈动脉插管抽血,分离血清,测定胰岛素、血脂、ox-LDL等指标。留取肾周、附睾周围脂肪,称重。3.将大鼠下肢骨从两端截断,用PBS反复冲洗骨髓腔,然后将离心管的冲洗液叠加于密度为1.081的大鼠淋巴细胞分离液上,2000转/min,离心20min,用吸管吸出悬浮的中间细胞带,置于另一15mL离心管中,加4倍体积的PBS,混匀后,1000转/min,离心10min,弃去上清液后再用重复洗涤1次。末次离心后,弃上清,加入EGM-2MY重悬细胞。接种到六孔板及24孔板中,接种密度为2×106个/mL。免疫细胞化学及多波长激光共聚焦显微镜鉴定内皮祖细胞。4.采集胸主动脉,用2.5％戊二醛固定,制备超薄切片进行透射电镜观察。5.所有数据采用SPSS13.0统计分析软件包进行分析。所有计量资料用均数±标准差((x)±s)表示,对所测定结果进行正态性及方差齐性检验,计量资料两组间比较采用t检验,P＜0.05为具有显著性差异。变量相关关系采用直线相关分析和多元直线回归分析。　　 结论:1.高脂喂养可导致肥胖、内脏脂肪增加、胰岛素抵抗。2.高脂喂养可导致大鼠骨髓内皮祖细胞数量减少、血管内皮细胞形态及功能改变。3.高脂喂养可导致大鼠血清SOD、GSH-Px、TAO-C水平减少、MDA水平增多,说明高脂饮食可导致大鼠体内出现氧化应激。4.在营养性肥胖大鼠,MDA是内皮祖细胞水平的影响因素,说明氧化应激影响大鼠骨髓源内皮祖细胞的数量和功能。　　 第三部分高脂饮食对大鼠骨髓内皮祖细胞谷胱甘肽过氧化物酶-1表达的影响　　 目的:观察高脂饮食诱导的肥胖大鼠骨髓EPCs GPx-1的表达,探讨高脂饮食对大鼠骨髓EPCs抗氧化能力的影响。　　 方法:建立高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型(同第二部分),分离、培养并鉴定EPCs,应用实时荧光定量PCR技术及Western-blot法测定EPCsGPx-1的mRNA及蛋白表达。　　 结果:高脂饲料喂养16周后,与NC组比较,HF组大鼠骨髓GPx-1表达显著减少(P＜0.001)　　 结论:高脂饮食可导致大鼠骨髓EPCs抗氧化应激酶表达下调而使其抗氧化应激能力减弱　　 第四部分α-硫辛酸对高糖状态下内皮祖细胞功能的影响　　 目的:应用高浓度葡萄糖孵育EPCs,诱发氧化应激,测定培养上清的丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平,同时观察EPCs的功能及GPx-1、eNOS的表达,然后应用抗氧化剂ALA进行干预,来探讨葡萄糖引发EPCs损伤的机制及治疗措施,为糖尿病血管并发症的预防及治疗提供依据。　　 方法:清洁级健康雄性Wistar大鼠(体重180-200 g)15只,分离培养EPCs,用0.25％胰酶/0.02％EDTA消化培养4天的EPCs,分组贴壁24 h后分别给予葡萄糖5 mmol/L作为正常对照组(NC)、30 mmol/l葡萄糖作为高糖组(HS)以及葡萄糖(30 millol/l)+α硫辛酸(40μg/l)作为ALA组,孵育EPCs48小时,实时荧光定量PCR技术及Western blot法测定EPCsGPx-1及eNOS的mRNA及蛋白表达,测定培养液上清的一氧化氮(NO)及MDA水平。统计学分析SPSS13.0统计分析软件包进行分析,采用单因素方差分析。　　 结论:1.高浓度葡萄糖可以诱发EPCs产生氧化应激。2.高浓度葡萄糖可以减弱EPCs的抗氧化能力及eNOS表达,使EPCs分泌NO减少,进一步损伤其功能。3.α硫辛酸能够改善高糖导致的EPCs抗氧化能力减弱及NO的分泌。