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目的 对重组人IL-12真核载体(pcDNA6-p70)进行表达鉴定并对其表达产物进行体外生物学活性分析;探讨pcDNA6-p70在实验小鼠体内对核酸疫苗的基因佐剂功能。 方法 pcDNA6-p70转染HEK293细胞,ELISA检测培养上清液中重组IL-12的表达。重组IL-12作用于献血员外周血单个核细胞(PBMC),分别应用细胞因子流式细胞(CFC)计数、Tetramer染色、NK杀伤实验、非特异性及特异性淋巴细胞增生反应等方法体外分析重组IL-12的生物学活性。pcDNA6-p70与人巨细胞病毒(HCMV)pp65基因重组腺病毒(adeno-pp65)共免疫小鼠(昆明小鼠及Balb/C)1次/2周,共8周。分别应用CFC,CTL杀伤实验,特异性淋巴细胞增生反应及受试小鼠血清及脾淋巴细胞的IFN-γ产生等评价pcDNA6-p70对核酸疫苗的基因佐剂功能。并对pcDNA6-p70在小鼠体内应用的安全性进行了初步的探讨。 结果 pcDNA6-p70转染HEK293细胞后,最高表达量达到517gp/ml(5×10~4细胞)。献血员PBMC经重组IL-12作用后,其对PHA及HCMV刺激的CD4/IFN-γ及CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的百分率(PHA:5.0、4.55;HCMV:7.78、5.82)高于对照组(PHA:0.3、1.05;HCMV:3.76、2.46);N9V特异性CD8+细胞百分率(1.19%)高于对照组(0.98%);NK杀伤活性及非特异性(PHA)、特异性(HCMV)淋巴细胞增生反应也显著增高,表明重组IL-12具有良好的生物学活性。pcDNA6-p70与adeno-pp65dx鼠体内共免疫结果显示,共免疫组NK杀伤活性(52.2%;单独免疫组46.4%;对照组44.9%)、CTL伤活性(74.9%;单独免疫组52.2%;对照组53.0%)、特异性淋巴细胞增生反应(1.204;单独免疫组1.113;对照组1.110)、特异性CD4/IFN-γ(5.17%;单独免疫组2.92%;对照组2.05%)、CD8/IFN-γ(4.24%;单独免疫组2.02%;对照组1.95%)双标记阳性细胞的百分率及特异性(150.5pg/ml;单独免疫组143.5pg/ml;对照组139.0pg/ml)、非特异性IFN-γ(146.7pg/ml;单独免疫组138.2pg/ml;对照组140.8pe/ml)释放均较adeno-pp65单独免疫组及生理盐水对照组增高。安全性评价结果表明,pcDNA6-p70实验组体温、体重及一般情况与对照组无显著差异。 结论 pcDNA6-p70在HEHEK293细胞中可表达较高水平的重组IL-12;表达的重组IL-12在体外表现预期的生物学活性;pcDNA6-p70与核酸疫苗共免疫实验小鼠可发挥较好的基因佐剂功能。初步安全性评价显示,其在实验小鼠体内应用具有较高的