论文部分内容阅读
胰腺癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在全世界范围内呈上升趋势,被称为“癌中之王”。胰腺癌是多基因、多步骤、多阶段演变的产物,因此针对单一环节的治疗临床上常不能达到满意的治疗效果。近年来有研究者提出将基因治疗与其他传统抗癌策略（如放射治疗、化疗、免疫治疗等）相结合,希望获得增强或协同的抗癌作用。基因治疗与放射治疗的联合是其中比较有前景的一种方案。ING4作为一个新发现的抑癌基因,它不但能抑制肿瘤细胞生长,诱导肿瘤细胞凋亡,还能抑制肿瘤组织中新血管的生成。鉴于ING4较好的抗肿瘤功能,因此我们通过腺病毒介导,将hING4基因转入人胰腺癌细胞株panc-1,联合持续低剂量率γ射线照射进行体外的抗肿瘤及其分子机制的实验研究,为其临床应用提供实验和理论基础。第一部分重组Ad-hING4转染Panc-1人胰腺癌细胞的体外实验研究目的探讨重组Ad-hING4对人胰腺癌panc-1细胞生长的影响,研究其体外抗肿瘤的效果。方法（1）重组Ad-hING4及Ad-GFP的扩增并进行效价检测及鉴定;（2）用Ad-hING4和Ad-GFP感染人胰腺癌细胞panc-1,在倒置显微镜和荧光显微镜下观察荧光表达情况及细胞生长抑制作用;（3）间接免疫荧光法检测Ad-hING4在人胰腺癌细胞panc-1中的表达;（4）MTT法检测Ad-hING4和Ad-GFP对细胞生长的抑制;（5）流式细胞仪检测Ad-hING4诱导凋亡的作用。结果（1）重组Ad-hING4及Ad-GFP的扩增、效价检测及鉴定重组病毒子经多轮感染、扩增后,Ad-GFP、Ad-hING4经荧光计数法检测其病毒效价滴度均达到1010pfu/ml。RT-PCR法鉴定重组病毒子,结果表明腺病毒介导的Ad-hING4基因能在Panc-1细胞中成功转录。（2）用Ad-hING4和Ad-GFP感染人胰腺癌细胞panc-1,在倒置显微镜和荧光显微镜下观察荧光表达情况及抑制细胞生长的作用在荧光显微镜下观察荧光表达,90%的细胞都表达GFP;Ad-hING4和Ad-GFP均呈现很高的感染效率;在荧光倒置显微镜下观察Ad-hING4处理的Panc-1细胞,出现明显变圆、脱落、皱缩等病变,表明Ad-hING4对Panc-1胰腺癌细胞具有明显的抑制细胞生长的作用。（3）间接免疫荧光法检测Ad-hING4在人胰腺癌细胞panc-1中的表达Ad-hING4处理的Panc-1细胞中有外源性ING4蛋白的表达。（4）MTT法检测Ad-hING4和Ad-GFP对Panc-1细胞生长抑制经Ad-hING4处理的panc-1细胞生长明显抑制,并呈现一定的剂量依赖性与时间依赖性。Ad-ING4在50MOI剂量点时,panc-1细胞出现较明显的细胞抑制效应,作用72h后,panc-1细胞的抑制率为28.7%。（5） FACS检测Ad-hING4对Panc-1细胞生长抑制Ad-hING4处理组可见明显凋亡峰,50MOI Ad-hING4处理72h的Panc-1细胞的凋亡率为24.2%。结论Ad-hING4能在胰腺癌Panc-1细胞中成功表达,并可在体外抑制其生长,诱导其凋亡。第二部分持续低剂量率γ射线照射人胰腺癌Panc-1细胞的体外实验研究目的125I粒子持续低剂量率γ射线体外照射胰腺癌Panc-1细胞,研究粒子照射对肿瘤细胞的杀伤机制及其与剂量的关系,为临床粒子治疗提供依据。方法自制细胞照射装置,采用125I粒子持续低剂量率γ射线照射胰腺癌细胞panc-1:（1）照射后用倒置显微镜观察细胞的形态学变化;（2）克隆形成率检测细胞增殖的改变;（3）流式细胞仪检测细胞凋亡的改变;（4） DAPI染色实验检测细胞凋亡的改变。结果（1）照射后用倒置显微镜观察细胞的形态学变化在荧光倒置显微镜下观察,经1Gy剂量照射Panc-1细胞,90%的细胞仍贴壁,细胞外形未见异常改变;而2、4、6、8、10Gy处理的Panc-1细胞出现明显变圆、脱落、皱缩等病变,并且随着剂量的增加发生CPE改变的细胞越多。（2）克隆形成率检测细胞增殖的改变不同照射剂量（1、2、4、6、8、10Gy）对Panc-1细胞克隆形成率的影响。未照射组集落形成率在本实验中为32.2%。给予panc-1细胞1、2、4、6、8、10Gy剂量后,细胞的克隆抑制率随剂量增大迅速上升。（3）流式细胞仪检测细胞凋亡的改变正常对照组与2Gy剂量照射处理组Panc-1细胞的凋亡率分别为1.3%、22.5%,各组坏死细胞比例均较少（<1%）。（4） DAPI染色实验检测细胞凋亡的改变125I粒子照射后panc-1胰腺癌细胞的细胞核断裂形成大小不等的核碎片,形成有膜包绕的含核碎片的凋亡小体。结论持续125I粒子γ射线照射均可显著抑制胰腺癌细胞panc-1的生长,诱导细胞的凋亡,具有一定的细胞毒作用。胰腺癌细胞panc-1的抑制率随γ射线照射剂量的增加,呈上升趋势。第三部分腺病毒介导的hING4基因联合持续低剂量率γ射线放射治疗胰腺癌的体外实验研究目的本研究使用重组Ad-hING4基因感染人胰腺癌细胞panc-1,并联合125I粒子持续低剂量率γ射线照射,研究其体外治疗胰腺癌的效果,并探讨其分子调控机理,为临床开展基因联合放射治疗提供实验依据。方法选用2Gy剂量与Ad-hING4基因治疗相联合,实验分5组,①正常对照组;②Ad阴性对照组;③Ad-hING4处理组;④单纯125I粒子处理组;⑤Ad-hING4及125I粒子联合处理组。观察并检测:（1）在倒置显微镜及荧光倒置显微镜下观察胰腺癌细胞panc-1的形态学改变;（2）克隆形成实验检测细胞增殖的改变;（3）流式细胞仪检测细胞凋亡的改变;（4）RT-PCR法检测凋亡抑制蛋白survivin基因mRNA的表达;（5）Western-blotting检测凋亡相关蛋白有活性的caspase-3的表达;（6）蛋白芯片法检测各组上清中肿瘤标志物CA199、CA242及CA153的表达。结果（1）在倒置显微镜及荧光倒置显微镜下观察胰腺癌细胞panc-1的形态学改变经Ad-hING4感染处理的Panc-1细胞,90%的细胞都表达GFP,呈现很高的感染效率;并且Ad-hING4处理组、125I粒子处理组及联合处理组的Panc-1细胞均出现明显变圆、脱落、皱缩等病变（CPE）,而正常对照组和Ad-GFP组未出现变圆、脱落、皱缩等病变。（2）克隆形成实验检测细胞增殖的改变各个实验组的克隆形成率分别为（32.93±0.61）%、（32.13±0.41）%、（21.87±0.81）%、（12.93±0.12）%、（7.73±0.76）%。联合处理组与正常对照组和Ad-GFP组相比,均有非常明显的差异（P<0.001）。Ad-hING4处理组和125I粒子处理组的克隆形成抑制率分别为（33.56±3.67）%和（60.83±0.88）% ,而联合处理组的抑制率高达（76.51±2.37）%,后者明显高于前两者（均P<0.001）。（3）流式细胞仪检测其凋亡的变化Ad-GFP组具有一定程度的抗肿瘤作用,但与正常对照组相比无明显差异（P>0.05）。与正常对照组及Ad-GFP组相比,Ad-hING4处理组、125I粒子处理组及联合处理组均能显著增加Panc-1细胞的凋亡率,分别为（17.80±3.03）%、（23.43±0.86）%、（51.23±5.05）%,而联合处理组比单纯125I粒子处理组凋亡率明显增高,高达（51.23±5.05）%。（4）RT-PCR法检测凋亡抑制蛋白survivin基因mRNA的表达Ad-hING4处理组和125I粒子处理组均可下调凋亡抑制蛋白survivin基因mRNA的表达,但联合处理组的下调作用更为明显。（5）Western-blotting检测凋亡相关蛋白有活性的caspase-3的表达Western印迹法也检测出联合处理组较其余组可明显上调凋亡相关蛋白有活性的caspase-3的表达。（6）蛋白芯片法检测各组上清中肿瘤标志物CA199、CA242及CA153的表达各组上清肿瘤标志物CA199、CA242及CA153,正常对照组与Ad-GFP组相比无明显差异（P>0.05）;与正常对照组和Ad-GFP组相比,Ad-hING4处理组、125I粒子处理组及联合处理组上清中的肿瘤标志物CA199、CA242及CA153均降低,各指标联合处理组下降最显著。结论Ad-hING4联合持续γ射线照射可在体外抑制胰腺癌细胞的生长,诱导胰腺癌细胞凋亡。Ad-hING4可能封闭凋亡抑制蛋白survivin,并通过上调细胞凋亡相关蛋白有活性的caspase-3的表达来抑制肿瘤的增殖、促进其凋亡,从而起到协同治疗胰腺癌的作用。