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基因工程的迅速发展和广泛应用对外源载体提出了更高的要求,而载体上的筛选标记基因显得尤为重要。近年来,随着对生存环境,人类健康,食品及转基因作物的安全性等问题的日益关注,基因工程中所用选择标记基因的生物安全性成为普遍关注的问题之一。生物安全性的标记基因不仅要求能够对宿主进行筛选和鉴定,而且必须对环境和生物都是安全的。从这个角度出发,本文对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和大肠杆菌(Escherichia coli)中可用的高效的生物安全性的筛选标记进行了较为系统的研究。
1.首先通过同源重组的手段敲除了裂殖酵母的己糖胺通路(Hexosaminebiosynthesis pathway,HBP)中第一步反应的关键酶GFAT的基因,构建了S.pombegfaA基因营养缺陷型菌株,gfaA基因缺失的酵母菌株在不加葡萄糖胺的情况下不能存活,表明该基因对S.pombe是个必需基因,并运用来自大肠杆菌入噬菌体的位点特异性重组系统Cre-loxP系统去除了染色体上的抗性标记基因,获得了S.pombe gfaA缺陷型的营养缺陷型菌株。并对S.pombeΔgfaA进行生理研究,较高的葡萄糖胺浓度对S.pombeΔgfaA的生长没有影响。以无抗性筛选标记基因的营养缺陷型菌株为出发菌株,为下一步的研究奠定基础。
2.将来源于高等担子菌草菇的gfaA基因和gfaA cDNA和S.pombe自身的gfaA基因克隆进裂殖酵母表达载体pREP3X,构建重组表达质粒并转化进S.pombeΔgfaA,通过表达实验发现草菇的gfaA cDNA和S.pombe自身的gfaA基因可弥补S.pombeΔgfaA的缺陷使其正常生长,为酵母中潜在的筛选标记提供了基因源,也为下面的筛选标记的应用研究提供理论依据。
3.构建适用于酵母的新的整合载体和表达载体,将可被来源于λ噬菌体的Cre重组酶识别的loxP位点引入整合载体pFA6a-KanMX6,构建了能方便消除野生型或营养缺陷型菌株中筛选标记基因的整合载体pFA6a-KanMX6-loxP。将pREP3X载体上原有的来自酿酒酵母的leu标记基因切除,得到载体pREP3Xd1。将来源于裂殖酵母自身的编码乙醇脱氢酶基因的组成型启动子adh1和异源的gfaA功能基因克隆入pREP3Xd1,获得带有新筛选标记基因的表达载体pADH-GFAT,这些载体的构建为酵母的基因工程提供了便利。
4.将本实验室合成的Thermomyces lanuginosus DSM5826的木聚糖酶基因xynA2用作报告基因,检测efaA基因作为筛选标记的有效性。将包括信号肽Cpy和xynA2基因的片段克隆至带有新筛选标记基因的载体pADH-GFAT,构建得到带有信号肽的重组质粒pADH-GFAT-cx,同时构建了不带信号肽的质粒pADH-GFAT-xynA2,转化进S.pombeΔgfaA感受态细胞进行表达。在不加葡萄糖胺的情况下,gfaA缺陷型菌株仍然能够正常生长,测带有信号肽的质粒转化后的酵母细胞胞外及胞内木聚糖酶的酶活,比酶活分别为28.8 U／ml和8.7U／ml。SDS-PAGE检测,显示该酶是胞外培养基中的唯一蛋白,无信号肽的质粒转化后胞内木聚糖酶的酶活为2.7 U／ml。对以gfaA基因为筛选标记基因的质粒在细胞中的稳定性进行实验,质粒传代50代后没有丢失,稳定性达到100％。gfaA基因作为新的高效的生物安全性筛选标记成功应用于裂殖酵母表达系统。
5.通过同源重组的手段对大肠杆菌K12编码Glms的基因gfaA进行敲除,并运用位点特异性重组系统FRT-FLP系统获得了无选择标记基因的E.coli K12gfaA缺陷型的菌株,gfaA基因的缺陷对大肠杆菌来说是致死的,在不含葡萄糖胺的培养基中不能存活,说明gfaA基因对大肠杆菌来说是必需基因。E.coliK12ΔgfaA在不加葡萄糖胺的情况下在含酵母粉的培养基中能够生长,培养基中的酵母粉成分所含有的极微量的葡萄糖胺使得E.coli K12ΔgfaA生长。对E.coliK12ΔgfaA在含葡萄糖胺和不同浓度酵母粉的M9培养基中的生长作了研究,发现0.1％的酵母粉即可以使缺陷型细胞正常生长,酵母粉浓度越高,细胞生长越快,后期生长阶段细胞在M9+葡萄糖胺的培养基中生长速度超越了细胞在M9+0.4％的酵母粉中的生长。在E.coli中gfaA基因在不含葡萄糖胺的培养基中仍然可以作为有效的生物安全性筛选标记发挥作用。