目的乙型肝炎呈世界范围流行,我国属高发区。其中母婴传播是HBV的主要传播途径之一,也是人群中大量HBV慢性携带者形成的重要原因。目前,由于乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白的使用,新生儿的感染率已明显下降,但仍有5%-15%的新生儿发生宫内感染。其具体机制目前并不完全清楚,可能与病毒本身、母体和胎儿等各方面因素有关。本课题组多年从事HBV宫内传播的研究,并提出了HBV通过“细胞转移”途径感染胎儿的假说,但其具体生物学机制尚不完全清楚。本课题组苏海霞发现,非宫内感染组母亲HBV前S/S基因突变率要高于宫内感染组母亲。因而,运用分子生物学的技术方法,从HBV基因结构入手,深入研究宫内传播中乙型肝炎病毒的基因突变,结合临床与流行病学的资料,分析HBV基因异质性与宫内感染的关系,筛选可能与宫内感染有关的特异性基因结构,将为HBV宫内传播机制的研究提供新的思路,对预防HBV宫内感染的发生具有重要的理论和实践意义。方法1.HBsAg阳性孕妇及其足月分娩的新生儿外周血的收集:2004年8月-2006年6月收集陕西省妇幼保健院妇产科足月分娩的HBsAg阳性孕妇及其新生儿外周血。根据新生儿发生宫内感染与否,将其母亲分为宫内感染组和未感染组。2.血清HBV标志物的检测以及血清HBV DNA的提取:采用ELISA法检测HBV标志物,并采用酚-氯仿抽提法提取血清HBV DNA,作为PCR的模板。3.目的片段的多聚酶链反应(PCR扩增)与克隆:设计引物对HBV前S/S、前C/C基因2.5Kb目的片段进行扩增,胶回收PCR产物,与pGM T载体连接。将重组质粒转入感受态细胞DH5α,氨苄青霉素和X-gal蓝白斑法筛选阳性菌落,并提取质粒进行限制性内切酶酶切分析鉴定。4.DNA测序与种系进化树分析:选择经鉴定pGM T载体内插入2.5Kb产物的菌液送检测序,应用MegAlign软件将获得的测序结果与GenBank中HBV标准株进行比较,构建种系进化树。5.核苷酸和氨基酸序列的组间比较分析:按照宫内感染组母亲、被感染的患儿和未感染组母亲,将基因序列的测序结果进行分组比较,比较各组之间突变发生的分布情况和核苷酸、氨基酸序列的差异。分析其对宫内感染的发生可能造成的影响。结果2.1一般情况共得到宫内感染组2例母亲(Ⅰ组)及其被感染的患儿(Ⅱ组),未感染组8例母亲(Ⅲ组)。宫内感染组母亲和未感染组母亲HBsAg OD值两组间无统计学差异(t检验,t=0.667,P=0.518),HBeAg OD值两组间亦无统计学差异(t=1.636,P=0.140)。2.2所有12例研究对象经PCR扩增均得到2.5Kb HBV基因组DNA片段,连接、转化后,感染组每例母婴各随机选取4-6个阳性克隆,未感染组每例母亲各随机选取2-3个克隆进行测序,成功得到41株克隆的测序结果,其中Ⅰ组:10株;Ⅱ组:10株;Ⅲ组:21株。2.3 HBV的基因分型通过对41株HBV序列的前S/S区基因序列和GenBank中A-H基因型标准株的前S/S区序列构建种系进化树,全部HBV株与C基因亚型标准序列(M12906)的进化距离最接近,而且与M12906的相似率最高,为96.5%-98.8%,属于C基因型。根据HBsAg第122位和160位氨基酸,判定所有序列血清型为adr亚型。2.4 HBV前S/S基因、前C/C基因突变方式及比较将41株HBV序列与C型标准株M12906比对,对前S/S基因、前C/C基因所发生的突变进行归类分析。所有突变主要以替代为主,插入和缺失仅散在见于不同株的个别位点。2.5可能与HBV宫内感染有关的突变位点通过对宫内感染组母亲、宫内感染组患儿和未发生宫内感染组母亲序列进行比较,筛选了可能与HBV宫内感染有关的19个位点,这19个位点的突变在三组之间的发生比存在显著差别(Fisher精确检验,P<0.05),且19个位点中,除nt3026外,其余位点的突变仅见于未感染组母亲。其中发生错义突变的位点有11个,发生无义突变的位点有2个,其余为沉默突变。nt2875和nt3026突变分别引起前S1区K10Q和V60A的氨基酸替代;nt3212突变使前S2区aa3 W变为终止码;nt287、nt339、nt435、nt531、nt810等五个位点突变分别引起S区T45A、L62P、P94L、T126I、S219F氨基酸替代,其中仅T126I替代位于“a”决定簇(aa124-147)表位内。nt1913、nt2149、nt2159、nt2189等四个位点突变引起C区T5P、D83E、G87S、L97I氨基酸替代;nt2444突变使C区aa182Q变为终止码。上述13个位点中nt3212、nt287和nt435在CTL细胞表位,nt1913、nt2149在CD4+Th细胞表位,nt2159、nt2189在B细胞表位。2.6突变对宫内感染可能造成的影响HBV前S1区的nt2875,nt3026的突变可能引起胎盘细胞对HBV的不识别或是HBV感染胎盘细胞失败;前S2区nt3212突变可能使病毒颗粒在未感染组母亲体内分泌减少,降低了病毒对宿主胎盘细胞的压力;S区和C区位点的突变可能使突变株的免疫反应性下降,影响HBsAg-抗-HBs复合物的形成,使之不能与相应的IgG-Fc受体或补体成分C3c结合,因而不能“逐层转移”至胎儿绒毛毛细血管内皮细胞,胎儿免获感染。结论1.宫内感染组母亲和未感染组母亲体内的HBV病毒株序列不完全相同;筛选了可能与HBV感染有关的19个位点,除nt3026外,其余位点的突变仅见于未感染组母亲。提示不具有上述突变的病毒株在宫内传播中可能具有选择优势。2.上述发生错义突变和无义突变的13个位点分布不同,提示不同区域氨基酸在HBV通过胎盘的过程中发挥着不同的作用。HBV宫内感染的发生可能与某些基因位点是否发生突变或其所在的功能区是否发生变化有关。3. HBV宫内感染的发生可能与病毒感染胎盘细胞的能力、病毒颗粒的分泌能力以及完整的抗原性和免疫原性等综合因素有关。