研究背景:　　 血小板是血液循环中最小的无核细胞，活化后具有粘附、聚集、分泌等生理功能，在止血与血栓形成过程中发挥重要作用。近年来，越来越多的证据显示，血小板除了上述传统的生理功能外，还是一种炎症细胞，合成和分泌多种炎性介质参与机体炎症性疾病的过程。　　 最早提出血小板与炎症关系是建立在动脉粥样硬化研究的基础上，血小板通过释放血小板因子-4(PF4)、白细胞介素-1β(IL-1β)、RANTES等炎性因子主动参与动脉粥样硬化的全过程。随后，脓毒症患者血小板数目的减少被认为与细菌内毒素诱导血小板活化，分泌大量的炎症介质，如TNF-α、IL-1β等有关，说明血小板在感染性炎症的发病中也扮演着重要角色。　　 Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是一种模式识别受体(patternrecognition receptors,PRRs)，有13种亚型(TLR1～TLR13)，能够辨别病原相关分子模式(pathogen-associated molecule pattern,PAMPs)，在机体识别微生物的天然免疫过程中发挥重要作用，其中针对革兰氏阴性细菌的主要是TLR4。脂多糖(LipopolySaccharide，LPS)，即细菌内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成份和最重要的致病因子，TLR4是它的特异性受体。2005年，Andonegui第一次证实了血小板表达功能性的TLR4，随后发现血小板TLR4能够介导LPS诱导的血小板活化，促进血小板分泌大量的炎症因子及氧化应激物。　　 一氧化氮(Nitrc Oxide，NO)属于氮氧化物家族，是一种具有重要生理功能的气体和自由基。NO由L-精氨酸在一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)的催化下合成。NOS具有三种亚型，即神经元型NOS(Neuronal NOS，nNOS)、诱导型NOS(Inducible NOS，iNOS)和内皮型NOS(Endothelial NOS，eNOS)。NO合成后，促进可溶性鸟苷环化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)生成环磷鸟苷(cyclic GMP，cGMP)，而cGMP作为第二信使激活细胞内的信号传导系统，改变细胞的生物学活性。已有研究表明，血小板表达iNOS和eNOS，LPS能够诱导血小板iNOS的表达从而增加NO的合成。我们之前的研究发现血小板eNOS—mRNA水平和NO量与动脉粥样硬化斑块形成有关；但LPS诱导血小板活化与eNOS的关系结论不肯定。　　 本实验通过观察LPS作用前后TLR4、CD62P、eNOS/NO的表达水平以及它们之间的关系，探讨TLR4在LPS诱导的血小板活化及NO合成中的地位，并对NOS系统在其中的作用进行初步的探索。　　 实验目的:　　 观察LPS作用前后血小板TLR4和CD62P的表达，阐明TLR4在血小板活化中的作用；同时检测血小板活化前后NO浓度，以明确TLR4在LPS诱导的血小板NO合成中所起的作用；进一步研究血小板eNOS与NO合成的关系，探讨LPS诱导血小板参与炎症过程的可能机制。　　 方法:　　 1.标本来源　　 健康献血员(25岁-52岁)，性别不限，无糖尿病、原发性高血压、血脂异常，无感染性疾病、慢性心肺疾病，无长期使用避孕药及吸烟史。抽血前30天内未服用阿司匹林、波立维、华法令等影响血小板及凝血功能的药物。　　 2.观察内容　　 1)不同浓度LPS作用前后血小板TLR4、CD62P的表达。　　 2)不同浓度LPS作用前后血小板eNOS/NO的表达。　　 3)抑制eNOS后LPS诱导血小板NO的合成及TLR4的表达。　　 4)阻断TLR4后LPS诱导血小板NO的合成及eNOS的表达。　　 3.实验方法　　 1)分组：①正常对照组(C组)；②凝血酶0.02U/ml组(T组)；③LPS1.0μgml组(L1组)；④LPS5.0μg/m组(L5组)；⑤LPS10.0μg/m组(L10组)；⑥L-NAME100μM组(N组)；⑦TRL4mAb1.0μg/ml组(B组)；⑧LPS1.0μg/ml+L-NAME100μM组(L+N组);⑨LPS1.0μg/ml+TLR4mAb1.0μgml组(L+B组)。以上各组在37C温箱孵育30分钟后进行各项相关检测。　　 2)血小板TLR4蛋白的表达：①流式细胞术法(Flow cytometry,FCM)；②Western Blot法。　　 3)血小板TLR4 mRNA的表达：RT-PCR法(Reverse transcription polymerasechain reaction，RT-PCR)。　　 4)血小板CD62P的表达：FCM法　　 5)血小板eNOS蛋白的表达：Western Blot法　　 6)血小板eNOS mRNA的表达：RT-PCR法　　 7)血小板NO的浓度：硝酸还原酶法　　 4.统计分析　　 1)采用SPSS16.0统计软件，检验水准定为P≤0.05。　　 2)计量资料的描述用均数±标准差(X±s)表示。　　 3)两独立样本均数的t检验。　　 4)多组均数比较的方差分析。　　 5)变量间的相关分析。　　 结果:　　 1.血小板TLR4的表达：FCM检测LPS作用前后血小板TLR4蛋白的表达率为　　 12.42±1.68％(C组)、19.47±0.05％(L1组)、33.5±4.76％(L5组)和32.94±0.69％(L10)组;Western Blot检测LPS作用前后血小板TLR4蛋白表达率为27.8±0.4％(C组)、38±0.7％(L1组)、39.8±0.5％(L5组)和39.4±0.5％(L10组)。对照组与各实验组差异均有统计学意义，L5和L10组间差异无统计学意义。血小板能检测到TLR4mRNA，但各实验组与正常对照组之间差异无统计学意义。　　 2.血小板CD62P的表达：FCM检测LPS作用前后血小板CD62P的表达率为0.24±0.07％(C组)、8.99±2.2％(L1组)、32.4±1.89％(L5组)和35.25±0.04％(L10组)。各实验组与正常对照组差异有统计学意义，L5和L10组间差异无统计学意义。　　 3.血小板eNOS的表达：Western Blot检测eNOS蛋白和RT-PCR检测eNOSmRNA在血小板均有表达，但各组之间差异无统计学意义。　　 4.NO浓度测定：硝酸还原酶法检测NO的浓度分别为1.16±1.14μM(C组)、19.33±3.41μM(T组)、12.51±3.01μM(L1组)、29.55±3.01μM(L5组)、22.73±4.10μM(L10)组、1.5±0.6μM(N组)、0.78±0.66μM(B组)、7.21±1.74μM(L+N组)和6.65±1.31μM(L+B组)。LPS各浓度诱导组及T组与C组比较差异有统计学意义，LPS各浓度组之间差异有统计学意义。N组和B组与正常对照组比较差异无统计学意义，L+N组和L+B组NO的合成量低于L1组，但高于C组，差异有统计学意义。　　 5.线性相关分析发现，血小板TLR4的表达与CD62P表达率呈正相关关系;血小板TLR4的表达与NO合成呈正相关关系。　　 结论:　　 1.LPS诱导血小板TLR4的表达和血小板活化　　 2.LPS能够诱导血小板NO的合成，但不影响eNOS表达　　 3.LPS诱导血小板活化和血小板NO的合成是由血小板TLR4介导的　　 4.血小板TLR4是血小板参与炎症过程的主要受体和机制