[研究目的]肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltration lymphocyte, TIL)是一群存在于肿瘤间质内的异质性淋巴细胞群,具有特异、高效的抗肿瘤作用,是过继免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy、ACI)的一种主要效应细胞。然而,虽然现有的制备方法能得到大量TIL,但经培养扩增的TIL抗瘤活性较低,临床疗效并不理想。研究表明,常规方法提取的TIL含有一定数量的调节性T细胞(regulation T cell, Treg),对于TIL的抗肿瘤活性具有抑制作用,并且TIL某些亚群分泌的TGF-β、IL-10能刺激Treg扩增而导致TIL抗瘤活性低下,是TIL应用于肿瘤治疗陷入困境的一个重要原因。因此,如何获得大量具有高抗瘤活性的TIL是过继免疫治疗的一个关键问题。本课题旨在建立一种寡克隆肝癌TIL培养方法,选择性扩增Treg含量少、抗瘤活性强的TIL细胞群,通过体外实验,了解TIL抗瘤活性与各种细胞因子之间的关系,通过小鼠体内实验,研究寡克隆TIL的抗肝癌作用,从而为寡克隆肝癌TIL的过继免疫治疗提供理论依据及实验基础。[研究内容与方法]1、H22肝癌荷瘤小鼠模型的建立收集对数生长期小鼠H22肝癌细胞,调整细胞浓度,取0.2mL(包含约5×106个肝癌细胞),接种于雄性BALB/C小鼠前肢腋窝皮下,待肿瘤生长至直径约1.0cm时,处死小鼠,取肿瘤用于肝癌TIL分离和培养。2、肝癌TIL分离、培养和鉴定寡克隆TIL培养法：在新鲜分离肿瘤后,在不同部位取多个大小约2.0mm3的肿瘤组织块,取材范围包括肿瘤中心至肿瘤交界区域(距肿瘤边缘内2mm)。将组织块置于24孔板中,加入特定培养基,5%C02条件下37℃恒温培养。常规TIL培养法：取新鲜肿瘤组织标本,取材范围包括肿瘤中心至肿瘤交界区域(距肿瘤边缘内2mm)。多种酶消化、钢网过滤、淋巴细胞分离液进行密度梯度离心,用0.2%台盼兰染色计数活细胞,之后进行培养扩增。3、过继免疫治疗实验选取肿瘤直径1.0cm左右的BALB/C异位移植瘤小鼠18只,随机分为对照组、常规TIL治疗组、寡克隆TIL治疗组,每组6只。通过尾静脉注射分别给予PBS液、常规培养的TIL和寡克隆培养的TIL后,监测小鼠生长、肿瘤体积变化。治疗30d后处死,收集外周血和肿瘤组织,测量瘤重,检测外周血细胞因子TGF-p、IL-10和IFN-y含量,观察肿瘤组织病理变化以及肿瘤组织内FoxP3和IL-17表达情况,并对实验数据进行统计学分析。4、主要检测方法(1)流式细胞术检测TIL纯度应用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测TIL中CD8+T细胞比例,鉴定TIL纯度。(2)MTT法分析TIL体外细胞毒性采用四甲基唑蓝(MTT)方法,以TIL为效应细胞,小鼠H22肝癌细胞为靶细胞,效靶比例10：1,分析TIL对肝癌细胞的杀伤活性。(3) ELISA法测定外周血细胞因子含量应用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法,检测外周血细胞因子TGF-p、IL-10和IFN-γ含量。(4)H&E染色和免疫组化法检测肿瘤组织内TIL及细胞因子应用H&E染色和免疫组化法检测肿瘤组织内淋巴细胞浸润程度以及FoxP3和IL-17的表达,并对实验数据进行统计学分析。[实验结果]1、建立H22肝癌荷瘤小鼠模型BALB/C小鼠皮下注射H22肝癌细胞3～4d后,可见皮下有肿块形成,并且随时间延长而不断增大,2w时用游标卡尺测量肿瘤直径约1.0cm。2、寡克隆肝癌TIL的分离培养及鉴定寡克隆培养3～4h后,可见有少量淋巴细胞游走出肿瘤组织块,24h后在组织块周围可见密集的淋巴细胞群。随着时间延长细胞数目不断增加,2w后数量可达到1.2×106/mL。分别收集寡克隆培养和常规培养的TIL,用流式细胞术检测CD8+T细胞的比例,寡克隆TIL培养法获得的CD8+T细胞数(71.25±9.09)%远高于常规TIL培养法(41.89±5.57)%,差异有统计学意义(P<0.01)。3、TIL对小鼠H22肝癌细胞的体外杀伤活性MTT法分析TIL体外细胞毒性的结果显示,在培养2w后,寡克隆TIL和常规TIL对H22肝癌细胞均有杀伤作用,杀伤率分别是(72.56±6.69)%和(46.24±4.03)%,差异有统计学意义(P<0.01)。4、TIL对小鼠肝癌移植瘤的抑制作用治疗后30d,常规TIL治疗组与寡克隆TIL治疗组的肿瘤体积分别为(1.172±0.085)cm3和(0.891±0.061)cm3,差异有统计学意义(P<0.05)；瘤重分别为(1.31±0.22)g和(0.91±0.09)g,差异有统计学意义(P<0.05)；均低于对照组肿瘤体积(1.714±0.040)cm3和瘤重(2.43±0.17)g,差异均有统计学意义(P<0.01)。寡克隆TIL治疗组抑瘤率(62.52±3.76)%明显高于常规TIL治疗组(46.13±9.21)%,差异有统计学意义(P<0.05)。5、TIL治疗后外周血细胞因子含量变化外周血细胞因子含量检测结果显示,治疗后30d,常规TIL治疗组和寡克隆TIL治疗组外周血TGF-β含量分别为(241.44±56.01)pg/mL和(65.73±44.79)pg/mL,差异有统计学意义(P<0.05)；IL-10含量分别为(166.52±59.20)pg/mL和(36.66±18.63)pg/mL,差异有统计学意义(P<0.01)；均低于对照组(388.21±18.67)pg/mL和(290.74±65.90)pg/mL,差异均具有统计学意义(P<0.05)。常规TIL治疗组和寡克隆TIL治疗组外周血IFN-γ含量分别为(538.57±103.43)pg/mL和(876.32±114.52)pg/mL,差异有统计学意义(P<0.05)；均高于对照组(106.66±12.93)pg/mL,差异均具有统计学意义(P<0.01)。6、TIL治疗后瘤内淋巴细胞浸润及细胞因子表达变化H&E病理染色结果显示,TIL治疗后30d,肿瘤组织内淋巴细胞浸润阳性率及中-强阳性率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)；常规TIL治疗组与寡克隆TIL治疗组相比,差异无统计学意义(P=0.330)。免疫组化法检测结果显示,TIL治疗后30d,肿瘤组织内FoxP3和IL-17阳性率及中-强阳性率均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)；常规TIL治疗组肿瘤组织内FoxP3阳性率及中-强阳性率均高于寡克隆TIL治疗组,差异有统计学意义(P<0.05)；常规TIL治疗组肿瘤组织内IL-17阳性率及中-强阳性率与寡克隆TIL治疗组相比,差异无统计学意义(P=0.682)。[结论]寡克隆TIL培养法能获得更高纯度的TIL,不仅在体外对小鼠H22肝癌细胞有更高的杀伤活性,在体内对小鼠H22肝癌移植瘤的生长也有更强的抑制作用。其机制与抑制Ireg细胞扩增,增加细胞因子IFN-Y分泌,降低细胞因子TGF-β、IL-10、FoxP3和IL-17表达有关。