论文部分内容阅读
目的:（1）将人角质形成细胞（human epidermal keratinocyte,HEK）与人脐带间充质干细胞条件培养基（Human Umbilical-derived Mesenchymal Stem Cell,HUMSCCM）共培养,探究其能否发生上皮间质样变（Epithelial Mesenchymal Transformation,EMT）样变。（2）探究HUMSC-CM中促进在EMT样变过程中可能的分子机制。（3）在体内验证HUMSC-CM加速创面的愈合的分子机制。方法:（1）分离、培养、纯化人脐带间充质干细胞（Human Umbilical-derived Mesenchymal Stem Cells）后,利用成脂、成骨、成软骨诱导分化培养基测定其三系分化潜能,借助流式细胞术检测特异性标记物（CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90）,对其进行表征;选用人角质形成细胞（human epidermal keratinocyte,HEK）细胞作为实验对象,收集人脐带间充质干细胞培养上清液,摸索出作用于HEK的适宜浓度后,分别利用MTT法和划痕实验、transwell实验对HEK的增殖能力和迁移能力进行检测;利用蛋白免疫印迹法（Western blot）对EMT的相关指标（E-cadherin、α-SMA、Slug）进行检测,以及应用细胞免疫荧光技术检测Ecadherin、Slug、β-catenin、α-SMA在HEK的表达水平变化,从而探究HUMSCCM对HEK细胞发生EMT样变的作用。（2）利用流式液相多重蛋白定量技术检测条件培养基中TGF-β1的含量;对HEK分别给予小分子药物TGF-β1及其抑制剂SB435142后,利用蛋白免疫印迹法检测EMT相关分子（E-cadherin、α-SMA、Slug）的蛋白表达水平;同时,利用慢病毒包装技术建立HEK敲除smad2的稳转细胞株,进一步探究TGF-β1/Smad信号通路介导EMT样变的作用;应用细胞免疫荧光技术检测E-cadherin、Slug、β-catenin、α-SMA在HEK的表达水平变化,探究TGF-β1/Smad信号通路在角质细胞发生EMT样变过程中的作用;利用划痕实验、transwell实验验证EMT样变后HEK的迁移能力的变化。（3）利用雌性裸鼠BALB/c建立全层皮肤损伤模型进行随机分组,创面注射HUMSC-CM作为治疗组,Epilife基础培养基组作为对照组,分别在损伤模型建立后第0、4、8、12天对创面愈合情况进行图像采集,利用Image J软件测定创面愈合率;切取创面组织进行H＆E染色,对治疗组和对照组的创面愈合情况进行比较,测量指征包括上皮化结构、表皮的厚度、炎症反应及血管再生等,从而探索HUMSC-CM在创面修复中的作用及其机制。结果:（一）脐带间充质干细胞三系分化诱导实验均为阳性,流式细胞检测特异性标记物阴性标记物所占百分比分别为CD14（0.42%）、CD34（0.6%）、CD45（0.11%）以及阳性标记物CD29（93.99%）、CD44（96.69%）、CD90（98.44%）证明提出来的细胞是脐带间充质干细胞;MTT实验显示,HUMSC-CM可以促进HEK细胞的增殖能力,划痕实验以及transwell实验显示HUMSC-CM可以促进细胞的迁移能力,Western blot结果显示添加HUMSC-CM后,HEK的上皮性标记物E-cadherin表达受到抑制,而间质性标记物α-SMA、Slug的表达增加,免疫荧光结果显示,HUMSC-CM处理后,上皮性标记物E-cadherin、β-catenin的表达受到抑制,而间质性标记物Slug、α-SMA受到促进,即HEK细胞发生了EMT样变。（二）HUMSC-CM相关分子含量测定发现TGF-β1的含量最多;Western blot结果显示在体外添加小分子化合物TGF-β1后,细胞的EMT样变的过程受到了促进,加入TGF-β抑制剂SB435142后,EMT样变的过程受到了抑制;对HEK细胞敲除Smad-2后,EMT样变的进程同样受到抑制,添加小分子化合物TGF-β1后,EMT抑制过程稍缓解;细胞免疫荧光结果显示,小分子化合物TGF-β1处理后,上皮性标记物E-cadherin、β-catenin的表达受到抑制,而间质性标记物Slug、α-SMA受到促进,即HEK细胞发生了EMT样变,且EMT样变的过程受到促进;划痕实验以及transwell实验显示,添加小分子化合物TGF-β1后,可以显著促进细胞的迁移能力,进一步证明是HUMSC-CM中的TGF-β1,导致HEK细胞发生了EMT样变。（三）小鼠的创面模型证实,添加脐带间充质干细胞条件培养基后,小鼠的创面愈合速度加快;免疫组化染色发现,添加HUMSC-CM的治疗组,小鼠的创面上皮的厚度明显高于对照组,皮肤的结构层次更完整;CK14阳性细胞主要集中在表皮的基底层以及亚基底层创缘内,表皮细胞增殖活跃,表皮层增厚,随着时间的延长,CK14阳性细胞呈现出向创面中心迁移的趋势。在治疗的第3d时,治疗组创面血痂下可见CK14阳性表皮细胞层而对照组血痂下为间明显的CK14阳性细胞层。结论:本研究对脐带间充质干细胞条件培养基促进小鼠皮肤创面愈合的分子机制进行了初步探索,发现脐带间充质干细胞通过旁分泌作用分泌细胞因子,通过激活TGF-β/smad信号通路作用于创缘残余角质形成细胞中,从而促进其EMT样变的过程,加快创缘残余角质细胞迁移至创口处,通过促进再上皮化的进程来促进创面愈合,为脐带间充质干细胞更广泛应用于临床各种创面治疗提供了理论依据,并为后续更深入的探究创面愈合的分子机制以及创面的完全愈合提供了新的更可行的思路。