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课题组前期研究证实：肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）通过TLR2?MyD88?NF-κB信号途径诱导B细胞成为分泌高水平IL-10的调节性B细胞（IL-10+Breg细胞），并依赖IL-10抑制T细胞的活化及其抗肿瘤作用；同时发现：TRAP能通过TLR4?MyD88?p38信号通路诱导单核/巨噬细胞成为高表达PD-L1和IL-10的M2样巨噬细胞，并通过PD-L1/PD-1和IL-10抑制T细胞的活化及其抗肿瘤作用。但是，TRAP是否能够调节中性粒细胞功能并在肿瘤免疫中发挥相应的免疫调节作用，有待进一步研究。 目的： 探讨肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）是否调节中性粒细胞的细胞生物学行为，研究TRAP诱导中性粒细胞凋亡的分子机制，初步探讨吞噬TRAP的中性粒细胞是否对T细胞和肿瘤细胞具有调节作用及其机制。 方法： 1.肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）调节中性粒细胞的细胞生物学行为的研究 人外周血中性粒细胞，与不同浓度CFSE标记的TRAP共孵育3h；或与3μg/mL CFSE标记的TRAP共孵育不同时间；或与3μg/mL CFSE标记的TRAP在4℃和37℃孵育3h，流式细胞术检测中性粒细胞吞噬CFSE标记TRAP的比例。人外周血中性粒细胞，与不同浓度TRAP共孵育6h；或与3μg/mL TRAP共孵育不同时间；或与3μg/mL的肺癌、卵巢癌和乳腺癌病人瘤性胸/腹水TRAP共孵育6h，流式细胞术检测中性粒细胞凋亡比例。 2.中性粒细胞摄取TRAP及其诱发细胞凋亡的分子机制研究 人外周血中性粒细胞，分别与CD（10μg/mL）、CPZ（4μg/mL）、FilipinⅢ（12μg/mL）和EIPA（20μM）预处理30min，再与3μg/mL CFSE标记的TRAP共孵育3h，流式细胞术检测中性粒细胞吞噬CFSE标记TRAP的比例；或分别与CD（10μg/mL）、CPZ（4μg/mL）、Filipin III（12μg/mL）和EIPA（20μM）预处理30min，再与10μg/mL的TRAP共孵育6h，流式细胞术检测中性粒细胞凋亡比例。人外周血中性粒细胞，与不同浓度TRAP共孵育30min；或分别与DPI（20μM）和NAC（7.5mM）预处理30min，再与10μg/mL的TRAP共孵育30min，流式细胞术检测中性粒细胞内ROS含量；或分别与DPI（20μM）和NAC（7.5mM）预处理30min，再与10μg/mL的TRAP共孵育6h，流式细胞术检测中性粒细胞凋亡比例。人外周血中性粒细胞，分别与CD（10μg/mL），EIPA（20μM）和DPI（20μM）预处理30min，再与10μg/mL的TRAP共孵育24h，检测中性粒细胞caspase-3活性；或与zVAD-fmk（50μM）预处理30min，再与10μg/mL的TRAP共孵育6h，流式细胞术检测中性粒细胞凋亡比例。 3.吞噬TRAP的中性粒细胞对T细胞和肿瘤细胞的调节作用及其机制的初步探讨 3.1吞噬TRAP的中性粒细胞对T细胞的免疫调节作用及其机制 人外周血中性粒细胞，与不同浓度TRAP共孵育30min，收获细胞，再与CFSE标记的PBMC共培养6天，流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞增殖情况。或与30μg/mL的TRAP在37℃共孵育30min，收获细胞，再与PBMC共培养3天，流式细胞术检测IFN-γ+T细胞比例，ELISA检测共培养上清中IFN-γ含量；流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞表面CD69和CD137以及PD1和CTLA4表达情况。分离人外周血中性粒细胞，与NAC（7.5mM）预处理30min，再与30μg/mL的TRAP共孵育30min，收获细胞，并与CFSE标记的PBMC共培养6天；或与CFSE标记的PBMC用Transwell小室分开共培养6天，流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞增殖情况。 3.2吞噬TRAP的中性粒细胞对肿瘤细胞生物学效应的调节作用及其机制 3.2.1吞噬TRAP的人中性粒细胞对肿瘤细胞生物学效应的调节作用及其机制 人外周血中性粒细胞，与10μg/mL TRAP共孵育12h，收获中性粒细胞培养上清，用所获上清培养MDA-MB-231细胞，观察MDA-MB-231细胞迁移、划痕愈合与侵袭情况。或与3μg/mL TRAP共孵育6h，qRT-PCR检测TRAP诱导中性粒细胞后CCL2和MMP9等分子的变化。或与10μg/mL TRAP共孵育12h，明胶酶谱实验检测TRAP诱导的中性粒细胞上清中MMP9酶活性。或在所获上清中分别加入MMP9封闭抗体及同型对照抗体，再培养MDA-MB-231细胞，观察MDA-MB-231细胞迁移与侵袭情况。 3.2.2吞噬TRAP的小鼠中性粒细胞对肿瘤细胞生物学效应的调节作用 小鼠中性粒细胞，与3μg/mL CFSE标记的TRAP共孵育3h，流式细胞术检测小鼠中性粒细胞吞噬CFSE标记TRAP的比例。或与3μg/mL的TRAP共孵育6h，流式细胞术检测小鼠中性粒细胞凋亡比例。或与10μg/mL TRAP共孵育12h，收获小鼠中性粒细胞培养上清，用所获上清培养Hepa1-6细胞，观察Hepa1-6细胞迁移与侵袭情况。采用B16F10细胞尾静脉输注小鼠，构建肺转移肿瘤模型，同时分别尾静脉输注PBS，Neutrophil（培养基对照）和Neutrophil（TRAP处理），两天后再次尾静脉输注PBS，Neutrophil（培养基对照）和Neutrophil（TRAP处理），接种第21天收获各组小鼠的肺脏，观察肿瘤结节数量及大小。 结果： 1.肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）调节中性粒细胞的细胞生物学行为的研究 中性粒细胞能够快速大量地吞噬TRAP，TRAP可诱导中性粒细胞凋亡。与DNase I和RNase A处理的TRAP相比，Proteinase K处理的TRAP诱导中性粒细胞凋亡的比例明显减少。与膜结构完整的TRAP相比，膜破碎的TRAP不能诱导中性粒细胞凋亡。 2.中性粒细胞摄取TRAP及其诱发细胞凋亡的分子机制研究 与CPZ和Filipin III预处理组相比，CD预处理组中性粒细胞吞噬TRAP的比例明显减少，同时中性粒细胞凋亡的比例也明显减少。与未处理组相比，EIPA预处理组中性粒细胞吞噬TRAP的比例明显减少，同时中性粒细胞凋亡的比例也明显减少。不同浓度的TRAP处理中性粒细胞后，ROS表达增加；用DPI或还原剂NAC预处理中性粒细胞后，TRAP诱导中性粒细胞产生的ROS含量明显减少，同时TRAP诱导中性粒细胞凋亡的比例也明显减少。与未处理组相比，CD、EIPA或DPI预处理中性粒细胞组caspase-3活性明显减弱；用caspase家族抑制剂zVAD-fmk预处理中性粒细胞后，TRAP诱导中性粒细胞凋亡的比例明显减少。 结论： 1.人中性粒细胞通过大胞饮方式，高效、快速吞噬TRAP，并定位于溶酶体； 2.TRAP通过触发中性粒细胞产生ROS并诱导caspase-3活化，进而在体内、体外促进中性粒细胞凋亡； 3.吞噬TRAP的中性粒细胞依赖ROS和细胞直接接触方式抑制T细胞增殖和IFN-γ产生； 4.吞噬TRAP的中性粒细胞通过MMP9促进乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移与侵袭； 5.吞噬TRAP的小鼠中性粒细胞促进肝癌Hepa1-6细胞迁移与侵袭，并促进黑色素瘤B16F10细胞体内肺转移及生长。