背景和目的 肺癌是世界上致死率最高的癌症,可分为小细胞肺癌(SCLCs)和非小细胞肺癌(NSCLCs)两类,其中非小细胞肺癌占肺癌总数的80%。肺癌预后极差,一般来说5年生存率大约为15%。基因靶向治疗已经成为新的肺癌治疗方向,了解肺癌的发生、发展机制,发现和认识新的治疗靶点以用于肺癌的诊断和治疗,对我们早日攻克肿瘤有的重要意义。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是在真核细胞中广泛存在非编码单链RNA,长度大约22个核苷酸,mi RNA能够通过和靶基因m RNA的3’UTR区碱基配对从而参与基因转录后的水平调控,对生物体的生长、分化、增值、凋亡等发挥调控作用。mi RNA表达异常会导致肿瘤在内的多种疾病的发生,目前关于mi RNA和肿瘤相关性的研究成为众多科学家关注的热点之一,mi RNA可能成为肿瘤诊断、治疗以及预后判断新的靶点。mi R-335定位于人染色体7q32.2处,在正常组织中广范表达。研究发现在不同肿瘤中扮演着复杂的角色。在胃癌、乳腺癌中mi R-335呈现低表达,高表达mi R-335可以导致肿瘤的侵袭和转移能力降低。而在星型细胞瘤中刚发现mi R-335高表达可以促进肿瘤侵袭和转移的作。因而mi R-335的不同作用可能具有组织特异性,目前关于mi R-335在非小细胞肺癌细胞的生物学作用及调控的分子机制仍然不是很清楚。本课题计划包含以下三部分:第一部分:非小细胞肺癌组织中mi R-335和Sp1、Bcl-w表达及与临床病理学特征相关性分析;第二部分:上调mi R-335表达对非小细胞肺癌细胞系A549生物学作用的影响;第三部分:mi R-335对Sp1、Bcl-W转录后调控作用机制的初步研究。第一部分非小细胞肺癌组织中mi R-335和Sp1、Bcl-w表达及与临床病理学特征相关性分析方法： 1.收集手术切除的72例非小细胞肺癌组织及相对应的癌旁正常组织标本。2.采用Agilent mi RNA芯片检测3例非小细胞肺癌组织及相对应的癌旁正常组织标本中mi RNA表达情况,分析差异化表达的mi RNA。3.运用q RT-PCR检测72例样本中miR-335和Sp1、Bcl-w mRNA表达,Spearman相关分析mi R-335表达与Sp1/Bcl-w m RNA表达的相关性。4.Western-blot检测Sp1和Bcl-w蛋白表达5.分析mi R-335和Sp1、Bcl-w mRNA的表达水平与非小细胞肺癌病人性别,年龄、肿瘤分化、TNM分期及有无淋巴结转移之间的相关性。6.应用SPSS18.0.软件进行统计分析,检验水准а=0.05。结果： 1.Agilent mi RNA芯片检测分析显示共有56个mi RNAs在非小细胞肺癌组织中表达异常,其中26个mi RNAs表达上调,30个mi RNAs表达下调。mi R-335在非小细胞肺癌中呈低表达(P<0.05)。2.q RT-PCR检测显示在非小细胞肺癌组织中,mi R-335表达水平较正常组织显著降低(P<0.05),其表达水平和Sp1、Bcl-w的m RNA表达水平呈负相关(R2分别为0.5231和0.6375)。3.非小细胞肺癌组织中mi R-335的表达水平与患者的淋巴结转移情况、分化程度以及TNM分期有关(P<0.05)。第二部分上调mi R-335表达对非小细胞肺癌细胞系A549生物学作用的影响方法：1.合成mi R-335前体序列,在其两端引入XhoⅠ和Eco RⅠ酶切位点,将其克隆到慢病毒载体p GV中,构建慢病毒载体p GV-mi R-335。2.将p GV-mi R-335、p Helper 1.0、p Helper 2.0质粒共转染至慢病毒包装细胞HEK-293T中,包装产生慢病毒并测定滴度。3.慢病毒感染A549细胞,筛选得到稳定感染的细胞株,q RT-PCR检测慢病毒感染后A549细胞中mi R-335表达。4.将细胞分为三组:实验组(重组mi R-335慢病毒感染细胞),无关对照组(mi R-NC慢病毒感染细胞);空白组(未感染A549细胞)。5.CCK-8法、平板克隆形成实验检测各组细胞增殖和生长能力。6.AnncxinV-FITC/PI双标记流式细胞术、Hoechst染色、Caspase-3检测各组细胞凋亡情况。7.Transwell小室实验、划痕实验检测各组细胞侵袭转移能力8.裸鼠移植瘤实验检测miR-335过表达对非小细胞肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的影响。结果： 1.经双酶切鉴定和测序表明成功构建了含有mi R-335的慢病毒载体,其感染A549细胞后mi R-335的相对表达量较空白细胞组和无关对照组显著升高(P<0.01)。2.CCK-8法检测结果显示mi R-335组细胞较无关对照组以及空白对照组吸光度显著减少。平板克隆形成实验结果显示mi R-335组细胞克隆形成数较空白对照组细胞和无关对照组著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.Anncxin V-FITC/PI双标记流式细胞术和Hoechst染色检测显示重组mi R-335慢病毒感染后A549细胞凋亡率较空白对照组和无关对照组显著升高,Caspase-3细胞活性较空白对照组和无关对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.Transwell侵袭实验发现实验组穿膜细胞数为(20.7±2.6)个,较空白对照组和无关对照组显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验显示重组mi R-335慢病毒感染A549细胞后,实验组划痕48h后划痕愈合速度明显慢于空白对照组和无关对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.裸鼠移植瘤实验表明实验组瘤块体积较正常对照组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。第三部分mi R-335对SP-1、Bcl-W转录后调控作用机制的初步研究方法： 1.通过生物信息学分析推测mi R-335的候选靶基因。2.构建重组载体pmirGLO-w-Sp1、pmir GLO-mut-Sp1、pmir GLO-w-Bcl-w、pmir GLO-mut-Bcl-w。采用双荧光素酶报告实验验证mi R-335的靶基因。3.构建表达载体pc DNA3.1-Sp1、pc DNA3.1-Bcl-w,通过回复实验分析mi R-335对A549生物学活性的调控。4.设计靶向Sp1和Bcl-w的si RNA序列,转染至A549细胞。分为以下5组:未转染的A549细胞(Blank组)、mi R-335慢病毒感染的A549细胞(mi R-335组)、Sp1 si RNA干扰表达的A549细胞(SP↓组),Bcl-w si RNA干扰表达的A549细胞(Bcl-w↓组),Sp1 si RNA和Bcl-w同时干扰表达的A549细胞(SP↓Bcl-w↓组)。q RT-PCR、Western blot检测各组细胞Sp1/Bcl-w m RNA和蛋白表达,CCK-8法检测各组细胞增殖,Anncxin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测各组凋亡,Transwell小室实验检测各组侵袭能力的变化结果： 1.生物信息学分析推测Sp1、Bcl-w为mi R-335靶基因。2.双荧光素酶报告实验显示mi R-335可以与Sp1、Bcl-w的3’UTR区结合,对其表达产生负调控作用。3.将不含Sp1和Bcl-w3’UTR区的重组载体pcDNA3.1-Sp1、pcDNA3.1-Bcl-w转染至A549细胞后,可以回复mi R-335对Sp1和Bcl-w蛋白表达的负调控作用,同时回复了mi R-335抑制A549细胞转移,促进细胞凋亡的能力。4.过表达mi R-335在A549细胞中可以起到和Sp1和Bcl-w si RNA相似的生物学效应,且较si RNA干扰能更有效的抑制A549细胞增殖、促进细胞凋亡。结论： 1.共有56个mi RNAs在非小细胞肺癌组织中表达异常,其中26个mi RNAs表达上调,30个mi RNAs表达下调。在非小细胞肺癌组织中,mi R-335表达水平较正常组织显著降低。其表达水平与患者的淋巴结转移、分化程度以及TNM分期有关。2.成功建立了高表达mi R-335的非小细胞肺癌A549细胞株。体外上调非小细胞肺癌细胞中mi R-335表达可有效抑制胞的生长、降低细胞侵袭能力,并且促进细胞的凋亡。动物实验表明mi R-335高表达能有效抑制裸鼠移植瘤生长。3.mi R-335是通过作用于靶基因Sp1和Bcl-w mRNA 3’UTR区对其进行转录后负调控,从而发挥相应的生物学功能。4.mi R-335发挥抑癌作用,有望成为非小细胞肺癌基因治疗新的靶点。