前言 研究表明癌前状态细胞凋亡异常，是肿瘤发生的重要原因，随着对细胞凋亡研究的深入，人们开始发现多数抗癌药物是通过不同渠道诱导敏感细胞凋亡而发挥作用的，它抑制、杀灭肿瘤细胞的主要机理，就是诱导肿瘤细胞发生凋亡。然而，在诱导肿瘤细胞凋亡的同时也不可避免地引起增生迅速的正常细胞同时发生凋亡。因此，增强的凋亡是引起化疗副作用的原因，其中，抗癌药物所致的末梢血白细胞凋亡亢进的报道在国外已有发表，且该研究表明外周血白细胞凋亡数的增长高峰早于白细胞减少的发生。因此，本研究的卵巢癌患者化疗病人为对象，以凋亡特异的形态学改变及流式细胞仪为依据，定性及定量的检测外周血白细胞凋亡，分析白细胞减少与细胞凋亡之间的相关性，并探讨细胞凋亡检测对于早期预测白细胞减少的可能性，并拟将方便，易行的流式细胞仪检测末梢血白细胞凋亡做为白细胞减少的早期诊断技术应用到临床当中，以便指导治疗。 实验方法 研究对象为25位因卵巢癌接受手术治疗、术后进行化疗的患者。化疗方案为CP方案(顺铂60～70m／m~2、环磷酰胺600～700mg／m~2)。标本取自每一位患者化疗前后两次的外周血各2ml，外周血的采集和分配：每一位患者于化疗前24小时内及化疗第5天都分别采取静脉血2ml，采用肝素(1000μ／ml全血)抗凝。其中：0.1ml血液用于检测血常规、0.5ml血液用于荧光显微镜观察白细胞凋亡，0.5ml血液用于流式细胞仪检测白细胞凋亡，0.9ml血液用于透射电镜观察白细胞凋亡。白细胞的分离纯化：0.5ml血液用于流式细胞仪和0.9ml血液用于电镜。 1．白细胞总数计数：由于外周血白细胞总数受生理性因素影响而波动，因此严格控制在清晨空腹状态采血。患者肝素化外周血白细胞总数及分数由血液检测实验室机器计数后，与人工计数相符合者为入选标准，分别测出化疗前、化疗后第5天的外周血白细胞总数。 2.外周血白细胞凋亡的检测 ①荧光显微镜形态学定量分析凋亡细胞，将每一次收集的0.5耐不凝血以巧oo印m离心10min后，分三层，取中层白色部分，制成浓度为1 x 107个/而的白细胞，制备叮吮橙储存液(10mg叮吮橙，100耐PBS)后，按l:19的比例(1闪叮陡橙，19闪白细胞悬液)混匀;吸1滴混合液滴在载玻片上，加上盖玻片;用激发滤片BG12，阻断滤片是5巧run的荧光显微镜观察，采取盲法计数100个白细胞中凋亡白细胞数，共计数3次，取3次凋亡细胞百分数的平均值计算出凋亡细胞百分数，照相并记录实验数据，做定量分析。 ②透射电子显微镜形态学定性分析凋亡细胞将用于电镜检测的分离纯化好的白细胞悬液，在透射电镜下观察白细胞凋亡形态及凋亡核的变化，照相记录，做定性分析。 ③流式细胞仪(FCM)定量分析凋亡核(subGI亚二倍体) 凋亡细胞核的百分比采用DNA荧光直方图上亚二倍体峰值计数。资料分析采用FIT细胞周期分析软件2.0(Beetion Diekinson)。 3.统计分析 实验结果均采用均值加减标准差，统计分析采用双侧配对t检验。两种实验分别采用直线回归相关分析;采用流行病学方法分析凋亡的检测用于预测白细胞减少的敏感性。实验结果 1.化疗前后末梢血白细胞总数的变化与化疗前比较，化疗后末梢静脉血白细胞数量减少具有显著性(p<0.05)，化疗前后末梢血白细胞总数分布分别为4.1一5.6 x 20，/L及2.0一7.9 x 10，/L。 2.荧光显微镜在形态学上定量分析化疗前后白细胞凋亡 ①与化疗前比较，在接受化疗后外周血白细胞凋亡的百分比均值加减标准差明显增加，两者差异具有显著性(P<0.05)。②采用直线相关分析荧光显微镜下患者化疗前后外周血白细胞总数与细胞凋亡数的相关性，白细胞总数与细胞凋亡数之间具有某种程度的逆向相关，其相关系数为R二一0 .736(P<0.05)。 3.透射电子显微镜形态学定性分析凋亡细胞 4.流式细胞仪检测外周血白细胞凋亡 ①流式细胞仪检测化疗前后外周血白细胞凋亡末梢血白细胞凋亡的变化。与化疗前比较，在接受化疗后外周血白细胞凋亡的百分比增加(p<0.05)。②用流式细胞仪采用直线相关分析检验了卵巢癌患者化疗前后末梢血白细胞总数与细胞凋亡变化的相关性，白细胞减少与细胞凋亡增加之间具有某种程度的相关性，其相关系数R二0 .646(P<0.05)。③采用临床流行病学分析方法检测细胞凋亡作为白细胞减少的早期诊断法的敏感性。灵敏度为82%，特异度为75%，准确度为so%，(p<0.05)。讨论 药物引起的细胞毒素是强化性抗肿瘤化疗骨髓抑制的重要原因，成熟粒细胞的死亡，代表了化疗药物所致粒细胞减少的另一方面。而这种死亡方式是经历逐步的细胞凋亡所致的。同时，粒细胞凋亡是经过数小时逐步过程完成的，细胞凋亡数所占的比例也是由化疗药毒性的强弱和化疗量的多少而呈正比例的动态变化。Chuknlovin Kusaka的研究得到这样的实验结果，化疗初期的末梢中白细胞凋亡数较化疗前末梢血白细胞凋亡数即呈现出明显的上升趋势。 在化疗药所致的骨髓抑制患者中白细胞凋亡数随着时间的变化而显著增加，