【摘 要】
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化学污染物广泛存在于自然环境中并影响着生命体正常功能,甚至能诱发肿瘤发生。识别与癌症发展有关的化学品是环境科学领域中重要的部分。传统的化学品促癌性评价方法主要是基于离体细胞或亚细胞测试以及啮齿类动物活体测试。其中细胞和亚细胞测试间接预测促癌风险的结果往往不够准确,啮齿动物活体测试由于操作难和花销大难以胜任大量化学品的测试工作。因此,当前急需建立能够实现促癌性化学品快速、高效的活体评价方法。斑马鱼作
【基金项目】
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中央高校基本科研业务费专项资金（2662017PY016）； 武汉市科技局高等应用研究计划（2019020701011482）；
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化学污染物广泛存在于自然环境中并影响着生命体正常功能,甚至能诱发肿瘤发生。识别与癌症发展有关的化学品是环境科学领域中重要的部分。传统的化学品促癌性评价方法主要是基于离体细胞或亚细胞测试以及啮齿类动物活体测试。其中细胞和亚细胞测试间接预测促癌风险的结果往往不够准确,啮齿动物活体测试由于操作难和花销大难以胜任大量化学品的测试工作。因此,当前急需建立能够实现促癌性化学品快速、高效的活体评价方法。斑马鱼作为毒理学研究的模式生物,近年来被广泛用于建立各种疾病模型。本课题借助一种转基因斑马鱼的肝癌诱导模型,建立能够高通量筛选环境促癌物的方法,并针对四类环境污染物进行促肝癌潜力的测试。根据筛选结果,借助肝脏病理学观察、转录组测序分析、实时荧光定量PCR、激素含量测定和相关验证实验等,探究环境污染物磷酸三（1,3-二氯-2-丙基）酯（TDCIPP）和咪唑类杀菌剂咪鲜胺（PCZ）对肝脏肿瘤发展的效应和作用机制。全文主要结果如下:（1）基于kras转基因斑马鱼的肝癌诱导模型,建立为期7天的繁养暴露体系。选择能够促进kras斑马鱼肝脏肿瘤发展的化合物脂多糖进行暴露测试,测定区域荧光面积和平均荧光强度,并通过组织病理学检查对测试结果进行验证。结果发现脂多糖暴露增加肝脏荧光蛋白表达呈现剂量依赖效应,且5μg/L脂多糖能够显著增加荧光面积和平均荧光强度。组织病理学检查的结果进一步证实5μg/L脂多糖的加入能够促进kras仔鱼肝脏肿瘤发展,表明该方法有良好的可操作性和可重复性。（2）基于上述建立的促肝癌性化学品的高通量筛选方法,开展了32种典型环境污染物的促肝癌潜力的测试,发现15种报道过具有促进癌症发展的化学品中有13种受试化学品同样能够促进kras仔鱼肝脏肿瘤发展,而另外17种未报道过与癌症生长有关系的环境污染物中有5种能够促进kras仔鱼肝脏肿瘤发展。除此之外,咪鲜胺和阿维菌素具有抑制kras仔鱼肝脏肿瘤发展的潜力。（3）以TDCIPP为研究对象,首先采用0.1、0.3和1 mg/L暴露kras仔鱼,发现0.3 mg/L TDCIPP能够促进荧光蛋白表达增强。再选用0.3 mg/L TDCIPP联合诱导剂暴露kras雌鱼和雄鱼,发现两种性别的斑马鱼均被诱导出肝脏肿瘤,且雌雄鱼的肝脏肿瘤发展具有明显的性别差异。TDCIPP的加入能够促进雌雄鱼肝脏荧光面积、肝体比显著性增加,组织病理学检查的结果发现TDCIPP能促进kras雌雄鱼肝脏肿瘤发展。转录组测序的结果揭示TDCIPP是通过上调炎症反应相关基因以及DNA复制通路相关基因的表达来促进kras斑马鱼肝脏肿瘤发展。而TDCIPP联合炎性抑制剂酮洛芬暴露kras与lyz双转基因斑马鱼证实TDCIPP能导致嗜中性粒细胞大量浸润肝脏,进而诱导炎症反应引起kras斑马鱼肝脏肿瘤的促进效应。（4）以PCZ为研究对象,选择三个时间点（暴露4、8和12天）来研究它与肝脏肿瘤生长的关系及作用机制。结果发现,4天的诱导kras雌雄斑马鱼不能诱导出明显的肝脏肿瘤,PCZ的作用效应不够显著。暴露8天,诱导剂能够诱发kras雌鱼和雄鱼绿色荧光蛋白的表达,且PCZ的加入能够减弱kras雌雄鱼荧光蛋白的表达以及肝体比,病理学检查的结果证实了PCZ能够抑制kras雌雄鱼肝脏肿瘤发展。暴露12天后PCZ虽然能显著减少雄鱼荧光蛋白表达,却不能减弱雌鱼荧光蛋白表达,组织病理学结果也发现PCZ能抑制kras雄鱼肝脏肿瘤发展,不能抑制雌鱼的肿瘤发展。19种类固醇激素含量的测定以及皮质醇与肝脏肿瘤发展相关参数的相关性分析发现皮质醇可能是PCZ影响kras斑马鱼肝脏肿瘤发展的关键激素。通过PCZ联合皮质醇暴露kras与lyz双转基因斑马鱼证实了PCZ能够抑制皮质醇引起的kras斑马鱼肝脏肿瘤发展的促进效应。
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