【摘 要】
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沙棘（Hippophae rhamnoides L.）具有优良的耐旱特质,是我国干旱、半干旱地区用于水土保持的优势树种,具有极高的生态与经济价值。TCP转录因子家族是植物响应非生物胁迫的重要调控因子。鉴于此,本实验为了探究TCP转录因子家族是否参与沙棘抵御干旱胁迫的应答过程,基于前期实验室沙棘转录组数据,通过序列分析比对得到了具有完整开放阅读框（ORF）的HrTCP转录因子家族成员,并获得了调控沙
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沙棘（Hippophae rhamnoides L.）具有优良的耐旱特质,是我国干旱、半干旱地区用于水土保持的优势树种,具有极高的生态与经济价值。TCP转录因子家族是植物响应非生物胁迫的重要调控因子。鉴于此,本实验为了探究TCP转录因子家族是否参与沙棘抵御干旱胁迫的应答过程,基于前期实验室沙棘转录组数据,通过序列分析比对得到了具有完整开放阅读框（ORF）的HrTCP转录因子家族成员,并获得了调控沙棘耐旱应答过程的关键基因HrTCP20。同时我们分别构建了HrTCP20基因的超表达载体与病毒介导的VIGS沉默载体,利用农杆菌蘸花法及VIGS沉默技术分别获得转HrTCP20基因的T3代超表达拟南芥植株和沉默沙棘植株,并对二者开展相关测定。主要结论如下:1.基于沙棘转录组数据,获得11个具有完整ORF框HrTCP转录因子成员,并对这11条序列进行生物信息学分析,获得可能参与沙棘抗旱的四个关键基因HrTCP4/7/19/20。干旱胁迫处理下,HrTCP4/7/19/20基因均被诱导表达,其中HrTCP20表达上调最为显著,为对照组表达量的24倍。激素处理条件下,发现外源施加茉莉酸甲酯（Me JA）后,HrTCP20基因的表达量极显著增高,为对照植株的5倍。由此可见,沙棘HrTCP20基因可能是使沙棘具有耐旱特性的关键基因。2.利用农杆菌蘸花法侵染拟南芥后,获得三个转HrTCP20基因株系（OE1/2/3）。对上述三个转基因株系进行抗旱功能鉴定,发现缺水条件下,与野生型植株相比,转基因拟南芥表现出更好的耐旱性,植株长势较好。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的峰值约为野生型的1.37倍和1.35倍,然而丙二醛（MDA）在OEs株系中降低了0.51倍。此外,转基因株系OEs植株叶片中的叶绿素（SPAD）含量显著高于野生型。综上,转基因拟南芥耐旱能力显著高于野生型,说明HrTCP20能参与植物体对干旱胁迫的应答反应,且是一个正向调控因子。3.利用VIGS沉默技术获得沉默HrTCP20基因沙棘植株。在沉默注射处理10 d后,沉默沙棘植株中HrTCP20基因的表达量相比于对照显著降低了2.86倍。进一步对沉默植株进行抗旱功能鉴定分析,发现用20%PEG6000处理后,相比于对照植株,HrTCP20沉默植株表型萎蔫较为严重,尤其叶片中过氧化氢酶（CAT）、POD、脯氨酸（PRO）、SOD和相对含水量（RWC）均显著降低,分别是对照植株的0.29、0.70、0.74、0.54和0.50倍;而MDA和相对电导率（REC）显著升高,是对照植株的1.47和1.39倍。由此可见,沙棘HrTCP20的基因沉默导致沙棘植株抗旱相关防御酶含量降低、活性氧含量积累增多以及膜的选择透过性能力降低,沙棘植株保水能力下降,进而导致其耐旱能力减弱。4.为了探究沙棘HrTCP20抗旱功能作用机制,对干旱前后沉默与空白植株体内抗旱相关植物内源激素含量进行测定,发现HrTCP20基因沉默后,茉莉酸（JA）含量显著降低,进一步发现JA合成通路上脂氧合酶合成关键基因HrLOX2表达量显著降低,表明沙棘HrTCP20的基因沉默会导致HrLOX2的表达降低,进而导致JA积累量减少。分别构建酵母双杂交载体p GADT7-HrTCP20和p GBKT7-HrLOX2,在互作实验前确定重组质粒菌株能正常生长且无自激活活性,可以进行互做验证。将重组质粒p GADT7-HrTCP20、p GBKT7-HrLOX2共转化进Y2H Gold酵母菌株进行酵母双杂交实验,发现两个蛋白存在互作关系。由此可见,沙棘HrTCP20与HrLOX2的互作,可能会促进JA的积累,进而提高沙棘植株的耐旱能力。综上,基于转录组数据分析、HrTCP20超表达与沉默植株抗旱功能鉴定、激素含量测定及蛋白互作鉴定,从多层次水平明确HrTCP20基因在沙棘响应干旱胁迫应答过程的生物学功能及其作用机制。
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