1. 研究背景和意义　　额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration，FTLD）是早发型（45-65岁）痴呆的主要原因之一，在由神经变性导致的痴呆中，FTLD为第三位原因，仅次于阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD）和路易体痴呆（dementia with Lewy bodies，DLB）。目前，FTLD发病机制尚不完全明确，且缺乏有效防治措施。以异常磷酸化的tau蛋白聚集导致的额颞叶变性tau病（FTLD with tau pathology，FTLD-tau）是FTLD中的一类重要的病理类型，包括进行性核上性麻痹（progressive superior nuclear palsy，PSP）,球型胶质细胞tau病（globular glial tauopathies，GGT），皮质基底节变性（corticobasal degeneration， CBD），皮克病（Picks disease，PiD）等疾病，约占FTLD患者总数的36-50%。在FTLD-tau患者脑内中，胞内tau蛋白过度磷酸化是引起tau蛋白聚集沉积，导致神经元轴突变性的关键因素。因此，异常磷酸化的tau蛋白被认为是FTLD-tau的重要干预靶点。但是，目前对调控胞内tau蛋白过度磷酸化的受体途径了解甚少，亟待探讨。　　近年来的研究发现神经营养因子系统信号失衡与中枢神经系统退行性疾病的发生发展密切相关，在疾病过程中主要表现为神经营养信号削弱，如脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）和Trk受体表达水平降低；而神经变性信号增强，如脑源性神经营养因子前体（precursor of brain-derived neurotrophic factor，proBDNF）、神经生长因子前体（precursor of nerve growth factor，proNGF）、p75神经营养因子（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）和sortilin水平增高。近年来发现p75NTR和配体proNGF在神经系统退行性疾病中的发挥作用。在生理条件下，p75NTR参与中枢神经发育过程中神经元存活和轴突生长的调控；而在病理条件下，如AD发生过程中，p75NTR介导了毒性配体Aβ和proNGF的神经毒性作用，诱导神经元轴突变性和死亡。研究表明，干预p75NTR具有AD防治潜力。另外，PiD患者脑内proNGF表达水平升高。p75NTR在介导proNGF诱导的神经变性死亡过程中，可激活JNK、GSK3β等信号分子。而这些信号分子正是调控tau蛋白过度磷酸化重要的激酶。这些研究结果高度提示p75NTR可能是tau蛋白过度磷酸化的重要调控受体。　　本研究拟探讨p75NTR在FTLD-tau发生中的作用：首先探讨p75NTR及其配体proNGF等在FTLD-tau患者脑内与tau蛋白磷酸化水平的关系，通过离体和在体实验证实p75NTR对FTLD-tau脑内神经元tau异常磷酸化的调控作用；进一步通过p75NTR基因敲除、信号通路阻断等策略，揭示p75NTR调控tau蛋白异常磷酸化的分子机制；最后探讨阻断p75NTR对FTLD-tau模型小鼠脑内tau相关病理和认知损害的影响，阐明以p75NTR为靶点来防治FTLD-tau的潜在作用和可行性。本研究有望揭示FTLD-tau脑内tau异常磷酸化的调控新途径和新机制，提供一个新的防治靶点。　　2. 材料与方法　　（1）p75NTR和proNGF表达水平的检测　　纳入10例FTLD-tau患者（其中包括7例PSP，1例CBD和2例GGT）和10例非痴呆对照者（non-demented controls，ND），采用免疫印迹方法检测前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）和内嗅皮层（entorhinal cortex，EC）组织中p75NTR和proNGF的表达水平；采用免疫组化方法检测前额叶皮层和内嗅皮层石蜡切片中proNGF在脑内分布；采用AT8-tau和p75NTR共染，检测前额叶皮层和内嗅皮层石蜡切片中p75NTR与磷酸化tau蛋白在脑内的表达和分布；采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR， qRT-PCR）检测前额叶皮层和内嗅皮层组织中编码p75NTR和proNGF的mRNA水平。　　选用携带P301L突变的tau转基因小鼠（P301L）为FTLD-tau模型小鼠，以12月龄的 P301L 小鼠和同月龄野生型小鼠为实验对象，采用免疫印迹方法检测小鼠脑内p75NTR和proNGF的表达水平；采用实时定量荧光PCR（quantitativeReal-time PCR， qRT-PCR）检测小鼠脑内编码p75NTR和proNGF的mRNA水平。　　（2）原代神经元培养　　采用新生P301L/p75NTR+/+（P301L）和P301L/p75NTR-/-小鼠大脑海马神经元原代培养，给予proNGF处理，检测tau蛋白磷酸化水平和AKT/GSK3β通路的变化；通过特异性阻断剂和激动剂的预处理，检测AKT/GSK3β信号通路对proNGF/p75NTR调控tau蛋白过度磷酸化的作用的影响。　　（3）构建降低p75NTR基因表达的FTLD-tau小鼠模型　　p75-/-小鼠与野生型小鼠杂交得p75+/-小鼠，p75+/-和P301L小鼠杂交得P301L/p75+/-， P301L/p75+/-再与p75+/-回交得不同年龄段（3月、6月、9月和12月）的实验所需小鼠基因型P301L/p75NTR+/+（P301L）、P301L/p75NTR+/-和野生型小鼠。观察各组小鼠的行为学、tau病理和信号通路的变化。　　（4）构建p75NTR胞外段干预FTLD-tau病的实验小鼠模型　　制备携带人p75NTR胞外段（p75NTR extracellular domain，p75ECD）编码基因的腺相关病毒载体（AAV8-p75ECD-Fc），采用侧脑室注射AAV-p75ECD-Fc（AAV-ECD，干预组）和AAV-green fluorescent protein（AAV-GFP，对照组）转染2月龄P301L小鼠， 12月龄时检测该干预措施对tau蛋白过度磷酸化、突触损害和神经元死亡等FTLD-tau相关病理，以及行为缺陷的改善作用。　　（5）行为学检测　　采用Morris水迷宫、旷场实验、Y迷宫检测不同年龄段的P301L、P301L/p75NTR+/-、野生型小鼠，以及AAV-ECD干预组和AAV-GFP对照组P301L小鼠的行为。所有行为学检测采用双盲法。　　（6）免疫组化和免疫印迹检测　　采用pT231-tau的免疫组化染色，观察不同年龄段的P301L、P301L/p75NTR+/-、野生型小鼠，以及AAV-ECD干预组和AAV-GFP对照组P301L小鼠的脑内tau蛋白磷酸化水平的差异。　　采用免疫印迹方法检测9月龄P301L、P301L/p75NTR+/-和野生型小鼠脑内不同位点的tau蛋白磷酸化水平（pT181、pT231、pS396和pS404）和AKT/GSK3β通路（pS473-AKT和AKT、pS9-GSK3β和GSK3β）的变化；采用免疫印迹方法检测AAV-ECD（干预组）和AAV-GFP（对照组）小鼠脑内不同位点的tau蛋白磷酸化水平（pT231和pS404）以及突触、神经元标志物水平的变化。　　（7）ELISA　　用TBS（tris buffer solution）和2%SDS（sodium dodecyl sulfate）序列提取9月龄P301L和P301L/p75NTR+/-小鼠、以及AAV-ECD和AAV-GFP小鼠脑内蛋白，检测不同溶解状态的tau蛋白磷酸化水平。　　（8）统计分析　　除另作说明，结果均以平均数±标准误的形式表示。实验结果的统计分析使用SPSS 19.0软件进行处理。两组之间的比较采用Student t-test或者Man-WhitneyU test，多组之间的比较采用one-way ANOVA或者two-way ANOVA。当P < 0.05（双侧检验）时认为有统计学差异。　　3. 结果　　（1）FTLD-tau患者和P301L小鼠脑内p75NTR和proNGF水平增高　　FTLD-tau病人大脑前额叶皮层和内嗅皮层的p75NTR和proNGF的表达水平显著高于其年龄与性别匹配的非痴呆对照组。P301L小鼠脑内的p75NTR和proNGF的表达水平同样显著高于正常对照组。qRT-PCR的结果显示，FTLD-tau病人和P301L小鼠脑内编码p75NTR和proNGF的mRNA的含量显著高于相应的对照组，这说明基因转录水平的升高导致了p75NTR和proNGF蛋白表达增加。　　（2）ProNGF调控tau蛋白磷酸化的受体信号通路　　使用免疫荧光染色检测 FTLD-tau 病人的大脑切片，发现 p75NTR 与磷酸化的 tau蛋白表达呈共定位。在FTLD-tau患者的前额叶皮层和内嗅皮层切片中，proNGF免疫反应阳性区域所占百分比显著高于非痴呆对照组。上述结果提示proNGF/p75NTR信号通路很可能是FTLD-tau脑内tau蛋白过度磷酸化的调控通路。　　使用proNGF蛋白处理培养的P301L小鼠海马原代神经元可以显著增加tau蛋白在Thr231位点（pT231）的磷酸化水平，这一作用呈剂量依赖特性。并且，由proNGF诱导的tau蛋白过度磷酸化在P301L/p75-/-神经元中显著减少，表明proNGF诱导的现象依赖于p75NTR。　　GSK3β是诱导tau蛋白磷酸化的关键激酶之一。使用proNGF蛋白处理，可显著降低培养原代海马神经元的GSK3β的Ser9位点磷酸化水平（pS9-GSK3β）和AKT的Ser473位点磷酸化水平（pS473-AKT）。敲除p75NTR基因，显著增加pS9-GSK3β和pS473-AKT水平，并降低 tau 蛋白磷酸化水平。另外，使用 proNGF 处理能细胞并同时给予anti-p75NTR 抗体阻断 p75NTR 的功能，可以以剂量依赖方式显著升高 pS9-GSK3β 和pS473-AKT水平。　　上述实验结果表明，AKT/GSK3β信号通路介导了proNGF/p75NTR诱发的tau蛋白过度磷酸化。　　（3）降低p75NTR基因表达可减轻P301L小鼠行为障碍　　在Morris水迷宫实验中，9月龄后P301L小鼠的获得性学习能力较野生型对照小鼠显著降低，而从6月龄开始，P301L小鼠的空间探索能力就显著低于野生型小鼠。降低p75NTR基因表达可减轻P301L小鼠的学习记忆缺陷，主要表现在：与P301L小鼠相比， P301L/p75+/-小鼠的逃逸潜伏期和测试最后一天的运动距离显著缩短，平台穿梭次数增加和平台所在象限停留时间增加，以及在平台所在象限运动路程增加。　　在Y迷宫测试中，与月龄匹配的野生型同窝小鼠相比，6月龄、9月龄和12月龄P301L小鼠的自发交替行为和空间再认记忆显著受损。而P301L/p75+/-小鼠在Y迷宫中的行为表现明显优于 P301L 小鼠，表现为：P301L/p75+/-小鼠的自发交替行为百分比更高，以及进入新臂的次数更多。　　在旷场实验中，9 月龄 P301L 小鼠的自主运动明显增强（极度活跃），运动距离和平均运动速度显著增加，以及反映焦虑程度的中央区域/周围区域运动距离和停留时间的比值显著降低。然而，与 P301L 小鼠相比，P301L/p75+/-小鼠的自主运动活跃程度明显减低，而焦虑样行为未发生改变。　　上述行为学测试结果表明，降低p75NTR基因表达可以改善P301L小鼠的行为缺陷。　　（4）降低p75NTR基因表达可减少脑内tau蛋白过度磷酸化水平　　在6月龄、9月龄和12月龄的P301L/p75+/-小鼠海马CA1区和内嗅皮层，pT231染色强度明显弱于同龄对照P301L小鼠。免疫印迹结果显示P301L/p75+/-小鼠的tau蛋白磷酸化水平（pT181、pT231、pS396和pS404）显著低于P301L小鼠。对不同溶解状态的tau蛋白的磷酸化水平的检测结果显示，P301L/p75+/-小鼠的tau蛋白Thr231位点磷酸化水平在 TBS 和 SDS 序列提取物中的含量均明显低于 P301L 小鼠。P301L 小鼠的pS9-GSK3β 水平和 pS473-AKT 水平均显著低于野生型小鼠。P301L/p75+/-小鼠的pS9-GSK3β水平和pS473-AKT水平均明显高于P301L小鼠。　　（5）阻断proNGF和p75NTR结合可以改善P301L小鼠的行为障碍和tau病理　　前述结果提示，调控p75NTR信号很可能是干预FTLD-tau病的潜在手段。过去发现p75NTR代谢释放的可溶性胞外段p75ECD，能够阻断p75NTR与其配体的结合。为此，我们进一步探讨使用 p75ECD 来阻断 p75NTR 与 proNGF 的结合，探讨能否缓解P301L小鼠的tau病理以及行为缺陷。　　首先，免疫印迹结果显示，FTLD-tau患者脑内的p75ECD与p75NTR的比值较非痴呆对照病例无明显差别，同样的，P301L小鼠的该比值与野生型小鼠相比也没有显著差异。但是，在细胞实验中发现，使用重组p75ECD-Fc蛋白（p75ECD fused with Fc fragment of humanimmunoglobin）或anti-p75NTR抗体处理原代培养的海马神经元能够显著缓解由proNGF诱导的tau蛋白过度磷酸化。　　然后，通过给予2月龄P301L小鼠侧脑室注射AAV-p75ECD-Fc（AAV-ECD）构建p75NTR胞外段干预tau病理的小鼠模型，并在另一组2月龄P301L小鼠的侧脑室注射AAV-GFP作为对照。在侧脑室注射AAV-GFP或AAV-ECD一个月后，转染的基因在小鼠脑内神经元中广泛和稳定表达，在基因转染10月后p75ECD-Fc在小鼠脑内稳定表达。　　行为学实验表明，AAV-ECD干预组P301L小鼠在Morris水迷宫探索实验中记忆提取能力明显改善，在Y迷宫中的空间工作记忆明显改善，在旷场实验中的自主运动活跃程度和焦虑样行为明显减轻。免疫印迹结果显示，AAV-ECD 干预组小鼠脑内 tau 蛋白在pT231和pS404两个位点的磷酸化水平明显降低。另外，在AAV-ECD干预组小鼠脑内TBS可溶性和TBS不可溶性（SDS溶解）tau蛋白水平同样显著降低。这两个实验结果表明使用p75ECD干预可以明显减轻tau蛋白的过度磷酸化水平。与使用AAV-GFP干预的对照组小鼠相比，使用AAV-ECD干预的小鼠脑内神经元变性死亡程度明显减轻，其中神经元结构相关蛋白Nestin、NeuroD1、NSE、NF-200、NeuN和MAP-2的表达水平明显增高。除此之外，AAV-ECD-Fc干预小鼠脑内突触相关蛋白synapsin-1、VAMP-1、PSD95和 SNAP-25的表达水平也明显更高。　　上述实验结果说明，p75ECD 干预具有神经保护作用，可以减轻 tau 蛋白突变导致的神经元死亡和突触损害。　　4. 结论　　在 FTLD-tau 患者和 P301L 小鼠脑内，p75NTR 和 proNGF 蛋白表达水平增加。proNGF/p75NTR 通路诱导 tau 蛋白过度磷酸化是 FTLD-tau 主要的病理机制之一。AKT/GSK3β是proNGF/p75NTR调控tau蛋白磷酸化的下游信号途径。阻断p75NTR可降低P301L小鼠脑内tau蛋白过度磷酸化水平，并改善行为障碍。　　综上所述，该研究揭示了proNGF/p75NTR在FTLD-tau脑内tau蛋白过度磷酸化发生中的作用，提示p75NTR是FTLD-tau病以及其他类型tau病的潜在干预靶点。