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幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）为一种革兰阴性细菌,是人类慢性活动性胃炎和消化溃疡的重要原因,被确认是胃癌和胃淋巴样组织淋巴瘤的危险因子。Hp感染与社会经济状况密切相关,在许多发展中国家其感染率超过50%,在发达国家达40%。Hp感染后若不采取特殊治疗措施常常为终身带菌。由于胃内的高酸性对抗生素有较大影响,所以,这些抗生素往往要与质子泵抑制剂和雷尼替丁枸橼酸铋同时使用。虽然组合抗生素方法对于治疗Hp感染是有效的,但是研制一种有效的疫苗将会更有益处,特别是在胃癌发病率高、感染复发率大和抗生素耐药性不断增高的国家。实验证明疫苗疗法对于Hp感染动物模型是相当成功的,然而在此基础上研制一种人类预防或治疗性疫苗仍然是非常困难的。采用众多候选疫苗进行的大量临床试验表明其效力较差。人类在通过口服抗体治疗和预防Hp方面也进行了许多尝试,实验证明口服抗尿素酶IgA单克隆抗体可保护小鼠不受猫胃螺杆菌（Helicobacter felis）感染。另有实验证实sIgA在儿童期防止消化道Hp感染中起着重要的作用,母乳中的IgA被摄入后能在消化道粘膜表面清除外来微生物或随食物吞咽下的抗原。Tharas在冈比亚的研究发现,生后第一年未感染幽门螺杆菌的婴儿的母乳其特异性sIgA滴度较感染婴儿的母乳中高2～4倍,表明了母乳通过抗体依赖机制在防止幽门螺杆菌感染上起重要作用,尤其是Hp感染的母亲其高浓度的特异性sIgA能大大延迟婴儿的幽门螺杆菌感染,而第二年以后的感染可能与母婴的密切接触以及断乳有关。以上实验说明特异性抗Hp sIgA在预防和治疗Hp感染方面具有重要作用。然而,单克隆抗体为鼠源且不能大规模生产,而从母乳中提取足量的sIgA分子也不现实。所以,有必要通过抗体工程技术获得大量特异性针对Hp的sIgA分子。1994年,Michette et al.首次利用纯化的Hp尿素酶作为抗原免疫小鼠,显示对猫螺杆菌（Hf）感染有良好的保护作用,分别口服Hp尿素酶（全部结构）或其A亚单位、B亚单位,再加上霍乱毒素（CT）作为佐剂,结果证明了起保护作用的是B亚单位（UreB）。另有许多实验证明,Hp UreB能够作为口服疫苗用于预防和治疗Hp感染。所以,我们决定构建抗Hp UreB sIgA分子。主要研究结果如下:1.抗Hp噬菌体单链抗体库的构建和筛选首先检测献血员抗Hp和rUreB抗体,分离阳性者外周血淋巴细胞,提取总RNA并等量混合。利用RT-PCR扩增全套重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因,分子量分别约为400bp和350bp。将VH和VL纯化后采用overlap方法连接,插入噬菌体载体pComb3x构建成库容量为4.6 x 108的单链抗体噬菌体库。以纯化rUreB为靶标包被96孔板,用3%BSA封闭液封闭,加入噬菌体孵育后,用洗脱液冲洗5次进行筛选。之后的筛选逐渐降低rUreB包被浓度,并增加冲洗次数。在5轮筛选之后,获得与rUreB发生反应的41个克隆,最强的克隆命名为scFv1,通过免疫印迹的方法证明,scFv1仅与rUreB和Hp菌株反应,不与非Hp菌株反应,因此,将scFv1送出测序。2.表达载体pcDNA3.1（+）:HSVHCα1和pcDNA3.1（+）:LSVLCλ2的构建首先分离人外周血中性粒细胞并提取RNA,采用RT-PCR的方法获得人IgA1重链恒定区（Cα1）基因,该片段分别含有EcoRI和XbaI酶切位点。重链信号肽编码序列是通过引物之间重叠延伸的方法获得的。该序列与VH片段的连接采用overlap的方法,连接物含有HindIII和EcoRI酶切位点。表达载体pcDNA3.1（+）:HSVHCα1是通过三个部分连接而成:（i）经HindIII /XbaI酶切的质粒pcDNA3.1（+）, （ii）经HindIII/ EcoRI处理的重链信号肽编码序列与VH片段的连接物,（iii）经EcoRI/ XbaI消化的Cα1基因。轻链恒定区（Cλ2）编码序列是从人脾细胞基因组DNA通过PCR获得的,该片段含有EcoRI和NotI酶切位点。轻链信号肽编码序列的获得采用与重链信号肽相同的方法。该序列与VL片段的连接同样采用overlap的方法,连接物引入HindIII和EcoRI两个酶切位点。表达载体pcDNA3.1（+）:LSVLCλ2同样由三部分装配而成:（i）经HindIII /NotI酶切的质粒pcDNA3.1（+）, （ii）经HindIII/ EcoRI处理的轻链信号肽编码序列与VL片段的连接物,（iii）经EcoRI /NotI消化的Cλ2基因。3.表达载体pcDNA3.1（+）Hyg:J Chain和pcDNA3.1（-）Bsd:SC的构建首先用SmaI和Bpu14I处理质粒pcDNA3.1 （+）以切除neoR抗性基因。hygR抗性基因是以质粒pMEP4 （Invitrogen）为模板通过PCR的方法获得的,分子量大约为1.1 kb,并且含有SmaI和Bpu14I酶切位点。用SmaI和Bpu14I酶切PCR产物后,与切除neoR抗性基因的pcDNA3.1（+）连接产生质粒pcDNA3.1（+）Hyg。人J链编码序列是以人脾细胞RNA为模板通过RT-PCR获得的,分子量大约为430bp,含有HindIII和NotI酶切位点。用HindIII和NotI处理RT-PCR产物和pcDNA3.1（+）Hyg后,将二者相连形成表达载体pcDNA3.1（+）Hyg:Jchain。分泌片（Secretory component,SC）的编码序列是采用RT-PCR方法从人结肠腺癌HT29细胞中获得的,含有HindIII和XbaI两个酶切位点。用HindIII和XbaI处理RT-PCR产物和质粒pcDNA3.1（-）Bsd,然后将二者相连形成表达载体pcDNA3.1（-）Bsd:SC。4.稳定表达特异性针对Hp UreB sIgA的CHO细胞的筛选首先用含有小牛血清、Hepes（pH 7.0）、青霉素和链霉素的IMDM培养CHO细胞。对1×107CHO细胞进行电穿孔,用ScaI-线性化的pcDNA3.1（+）:HSVHCα1和BglII-线性化的pcDNA3.1（+）:LSVLCλ2转染CHO细胞。24 h后用500μg/ml G418开始筛选,连续进行3周。挑取单克隆于96孔板,dot-ELISA法检测细胞培养上清。对表达最大量IgA1的克隆（Clone1）进行扩大培养,用BglII–线性化的pcDNA3.1（+）Hyg:Jchain进行电转染。在500μg/ml G418和400μg/ml潮霉素同时存在的条件下筛选,从而获得了表达最大量dIgA的克隆（Clone 2）。对1×107CHO细胞进行电穿孔,然后用BglII-线性化的pcDNA3.1（-）Bsd:SC进行转染。24 h后用10μg/ml杀稻瘟菌素开始筛选,连续进行3周。挑取单克隆于96孔板,dot-ELISA法检测细胞培养上清,获得表达最大量dIgA的克隆（Clone 3）。将Clone 2和Clone 3细胞培养上清浓缩,37℃作用2h。这样,通过dIgA和SC结合我们得到sIgA分子。sIgA的特异性通过免疫印迹的方法证明,sIgA仅与rUreB和Hp菌株反应,不与非Hp菌株反应。另外,Hp菌株与sIgA作用后,其粘附胃上皮细胞GES-1的能力大大减弱,证明sIgA具有阻断Hp粘附胃上皮细胞的作用。总之,我们通过实验证明了可在异种哺乳细胞中生产人sIgA全分子,而且特异性针对Hp UreB sIgA可以阻断Hp粘附胃上皮细胞GES-1。我们的数据说明sIgA可能会成为抗生素治疗无效患者的替代或者补充治疗方法。