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仔猪早期断奶应激综合征是制约集约化养猪发展的瓶颈问题,往往导致仔猪生长发育缓慢,饲料报酬降低,易受到外源病原物质的侵害而发生疾病。新近研究表明,断奶导致仔猪发生严重的氧化应激,引起肠道屏障功能障碍,这是诱发断奶应激综合征的重要原因。目前,生产上普遍采用仔猪21d断奶,14d超早期断奶也已受到国内外学者的关注。但目前尚无不同日龄断奶仔猪氧化应激损伤及其机理的系统研究。本研究以仔猪超早期断奶(14d断奶)和早期断奶(21d断奶)应激为模型,比较不同日龄断奶对仔猪抗氧化能力、免疫力和肠道菌群变化的影响,研究超早期断奶仔猪肠道细胞凋亡的发生发展规律,旨在解析超早期断奶仔猪肠屏障功能发育的机理,为根据不同日龄断奶仔猪肠道屏障功能发育特点,建立缓解仔猪早期断奶综合症的策略和方法提供理论依据。1.不同断奶日龄对仔猪抗氧化能力的影响选择10窝健康初生仔猪随机分为2组,每组5窝,分别在14d和21d时每窝1/2仔猪断奶,1/2仔猪继续哺乳。断奶4天即18d(14d断奶组)和25d(21d断奶组)时每窝随机取1头屠宰取样,测定血清和回肠、直肠和盲肠超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)和一氧化氮(NO)的含量；同时测定血清二胺氧化酶(DAO)、肠脂肪酸结合蛋白(IFABP)和皮质醇的含量。结果显示,不同日龄断奶仔猪血清中皮质醇含量均显著高于同日龄哺乳组(P<0.05),说明应激状况的存在；而21d断奶仔猪血清皮质醇含量高于14d断奶仔猪,说明断奶日龄越高对应激的敏感性越强。但是断奶日龄对血清DAO和IFABP的含量无显著影响(P>0.05)。14d和21d断奶均会导致仔猪血清抗氧化能力降低,但14d断奶对GSH-Px活力及MDA、H2O2和NO含量无显著影响(P>0.05),21d断奶仔猪血清抗氧化能力高于14d断奶仔猪,说明机体抗氧化能力随日龄而增加,21d仔猪抗氧化能力相对发育充分。14d断奶仔猪回肠MDA、H2O2和NO的含量显著高于对照组仔猪(P<0.05),直肠中SOD和GSH-PX的活性显著降低(P<0.05),而H2O2和NO含量显著提高(P<0.05)；14d断奶组仔猪盲肠中GSH-Px的活性显著低于对照组(P<0.05),MDA和H2O2的含量显著高于对照组(P<0.05),21d断奶仔猪肠道中NO和H202含量显著低于14d断奶组。结果提示超早期断奶应激诱导仔猪血清和肠组织抗氧化能力降低,更易受到自由基的攻击,而肠道是最易受到损伤的组织。2.不同断奶日龄对仔猪免疫能力的影响探讨不同断奶日龄断奶对仔猪免疫能力的影响。测定断奶仔猪器官指数,血清中免疫细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IgM及IL-1β的含量,并利用实时荧光定量PCR法检测仔猪脾脏中IL-2、IL-4、IL-6及IL-1p的基因表达。结果显示,不同日龄断奶仔猪的器官指数及血清免疫因子IgM、IL-4均无显著差异(P>0.05),且各组别之间也无显著影响(P>0.05)。14d断奶仔猪血清IL-2水平极显著高于14d哺乳组仔猪(P<0.05),而14d断奶仔猪血清中的IL-2水平显著低于21d断奶组(P<0.05)。14d断奶仔猪血清IL-6水平相对于14d哺乳组无显著性差异(P0.05),而21d断奶仔猪血清中IL-6水平极显著高于21d哺乳组和14d断奶组仔猪(P<0.01)。荧光定量PCR结果显示,14d和21d断奶后,仔猪脾脏中免疫因子IL-6的表达都显著高于对照哺乳组(P<0.05),而IL-1p表达无显著差异(P>0.05),14d断奶后,仔猪脾脏中IL-2表达显著高于14d哺乳组(P<0.05)。21d断奶后仔猪脾脏中IL-2表达无显著差异(P>0.05)。14d断奶后仔猪脾脏中IL-4表达显著高于14d哺乳组(P<0.05)。不同断奶日龄对仔猪血清免疫细胞因子含量有着不同程度的影响,相较于21d断奶,14d断奶仔猪表现出更好的免疫应答能力。3.不同断奶日龄对仔猪肠道菌群发育的影响探讨不同断奶日龄对仔猪肠道菌群的影响。采用荧光定量PCR法测定不同肠段主要菌群数量的变化。结果显示,14d断奶和21d断奶仔猪回肠、直肠、盲肠中乳酸杆菌显著降低(P<0.05),而回肠、直肠、盲肠中大肠杆菌显著增加(P<0.05)。断奶仔猪盲肠中双歧杆菌的数量也显著降低(P<0.05)。断奶后仔猪的不同肠段乳酸杆菌和双歧杆菌数量与SOD、GSH-Px酶活力显著正相关(P<0.05)而与MDA、H2O2以及NO含量显著负相关(P<0.05)。结果表明不同日龄断奶均会导致仔猪肠道中乳酸杆菌和双歧杆菌数量减少,大肠杆菌数量增加,断奶仔猪肠道中菌群变化与肠组织抗氧化状态及自由基水平显著相关。4.超早期断奶对仔猪肠细胞凋亡的影响及分子机理探讨超早期断奶(14d断奶)对仔猪肠细胞凋亡的影响及其机理。采用HE检测断奶仔猪肠绒毛形态学变化,利用TUNEL染色、电镜技术及荧光定量PCR法检测断奶仔猪肠上皮细胞凋亡。结果显示,超早期断奶对仔猪肠壁厚度、肠绒毛高度、肠绒毛宽度均无显著影响(P>0.05),但是超早期断奶显著增加空肠隐窝深度(P<0.05)。断奶后仔猪肠上皮细胞凋亡增多,尤其是绒毛顶端和肠上皮的固有基层凋亡比较严重,细胞凋亡指数显著增加(P<0.05)。小肠黏膜表面微绒毛排列疏松,部分区域微绒毛脱落,胞浆内有少量空泡。而同龄哺乳组仔猪小肠黏膜表面微绒毛排列较紧密,细胞连接较紧密,线粒体形态正常,少量线粒体嵴破坏,细胞核染色质部分凝集。断奶仔猪小肠中促凋亡基因Bax表达上调,抑制凋亡基因Bc12表达下调,在凋亡过程中起重要作用caspase-3、caspase-8、caspase-9基因表达显著上调(P<0.05),死亡诱导因子Fas表达显著上调(P<0.05)。结果提示,超早期断奶可激活仔猪肠上皮细胞凋亡的死亡受体和线粒体调控途径的激活。本研究得出以下结论：(1)不同日龄断奶均会导致仔猪肠组织抗氧化能力降低,脂质过氧化严重,H202和NO含量显著增加,且仔猪血清抗氧化能力随日龄增加。21d仔猪抗氧化能力相对14d发育更充分,14d断奶仔猪肠道更易受到自由基攻击。(2)不同日龄断奶对仔猪血清中细胞因子水平有着不同程度的影响。断奶激活机体主动免疫应答,仔猪免疫能力降低,促进炎性因子的释放。14d断奶对仔猪免疫能力的影响要低于21d断奶。(3)不同日龄断奶应激导致仔猪肠道氧化还原环境的改变,由此引起肠道菌群的紊乱,肠道大肠杆菌的含量增加,乳酸杆菌和双歧杆菌的数量减少,断奶应激造成的菌群变化与仔猪肠道抗氧化状态以及自由基水平显著相关。(4)超早期断奶加速仔猪肠上皮细胞的凋亡,破坏肠上皮细胞的完整性。超早期断奶可激活仔猪肠上皮细胞凋亡的死亡受体和线粒体调控途径的激活。