生物碱为药用石斛具有生物活性的次生代谢产物，当前，药用石斛资源日益匮乏，且石斛生物碱含量一直较低，因此通过组织培养调控石斛生物碱含量成为亟待解决的问题。　　 NO是新型信号分子，具有参与植物生长发育、诱发植物抗逆反应等多种功能，有关NO对药用植物次生代谢物合成的调控作用报道不多，因此，探讨NO对药用石斛生物碱的调控技术具有重要的理论意义和应用价值。　　 本研究以种质改良品种霍山杂交石斛为材料，建立类原球茎的液体悬浮培养体系，开展类原球茎生物碱的细胞定位及其提取测定方法优化改良的研究。试验以SNP作为NO的供体，重点研究NO单独处理及NO与60Coγ辐照复合处理对石斛类原球茎次生代谢生物碱积累的调控，探讨了外源NO调控石斛生物碱的机制，并克隆了苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因，为提高石斛生物碱含量提供理论依据和实践参考。主要研究结果如下：　　 1、建立了霍山杂交石斛类原球茎的液体悬浮培养体系。由杂交石斛种子萌发培养试管苗，利用试管苗茎段诱导类原球茎。种子萌发的适宜培养基为：不含激素的1/2MS+香蕉提取物培养基，接种后先黑暗再光照下培养，萌发率高达96.5％。类原球茎诱导适宜培养基为：Knudson+KT0.05 mg·L-1+2，4-D0.1 mg·L-1，悬浮培养适宜培养基为：MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1 NAA+40 g·L-1蔗糖。从类原球茎形态发生、生长曲线以及生物碱积累曲线表明，类原球茎液体振荡培养适宜的继代周期为45d。　　 霍山杂交石斛类原球茎综合了其亲本的优点，有效成分生物碱产量达到超亲优势。　　 2、石蜡切片显微观察，霍山杂交石斛体细胞胚的发生经历了原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶胚期，最后发育为成熟胚。类原球茎形态发育过程大致分为类原球茎形成期、类原球茎肥大期、茎叶分化期、茎叶形成期以及茎叶伸长期等5个时期，直至形成完整的植株。　　 3、从石蜡切片观察到石斛生物碱主要分布在类原球茎的细胞质中。利用正交设计筛选石斛生物碱提取优化条件为：1:30料液比、提取时间2h、回流提取温度80℃。石斛总生物碱测定的酸性染料改良法，发现添加0.4ml的1:80的非离子表面活性剂吐温-80对石斛生物碱的测定体系有明显的增敏作用。　　 4、利用NO的供体SNP处理杂交石斛类原球茎，对类原球茎生长有一定的抑制作用，但有利于生物碱的积累，SNP适宜的处理浓度为0.1mmol·L-1，由于NO处理，类原球茎相对电导率明显增加，高浓度的NO对杂交石斛类原球茎组织细胞损伤严重，电镜超显微观察细胞核质解离，细胞走向凋亡。　　 与对照比较，石蜡切片染色观察，经NO处理的石斛类原球茎细胞质中生物碱褐色颗粒明显增多，电镜超显微观察与次生代谢相关的晶状体累积增加。　　 5、NO作用机理的初步研究表明，NO处理的类原球茎在生物碱积累高峰期45d前，30d时发生活性氧迸发，POD、CAT、SOD等抗氧化酶活性提高，同时发生抗逆反应，30 d时PAL活性达高峰；NO处理提高类原球茎内源激素含量，从而诱导生物碱含量的提高。通径分析表明，内源激素SA在生物碱积累中起首要的直接效应。　　 NO单独处理组的生物碱产量比对照组提高了8.8%，NO和60Coγ辐照复合处理对生物碱的合成有一定的互作累加效应，0.1mmol·L-1SNP+10Gy60Coγ辐照复合处理的生物碱产量比对照提高了18.5%。抑制剂阻断法结果表明，NO抑制剂L-NAME和cPTIO均能抑制SNP单独处理和复合处理导致的类原球茎生长量的降低和生物碱积累的促进作用。　　 6、类原球茎继代培养表明，不经NO诱导的S0、S00、S000三代类原球茎的蛋白质条带和POD同工酶条带基本一致，反映了霍山杂交石斛继代的稳定性，而NO处理可诱导某些特定基因的表达，使蛋白质条带和POD同工酶条带呈现差异性。NO处理后类原球茎生物碱含量的提高尚不能随继代保持。　　 7、克隆出杂交石斛PAL基因片段。以霍山杂交石斛类原球茎为材料，通过基于同源性的RT-PCR方法，克隆PAL基因片段(GenBank登录号：HQ337614)，DhhPAL的cDNA片段长度为543bp，推测编码181个氨基酸。在NCBI上进行BlastP搜索，发现它与其他植物来源的PAL基因同源性较高，达90%。该基因在推测的氨基酸序列中含有植物PAL基因所特有的催化活性位点N73、D74、N75、H87、HNQDV(177-181)。