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目的:非综合征型唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with palate,ns CLP)是一种常见的先天畸形,具有较高的致死率和致畸率,通常是由胚胎发育早期唇腭部融合失败引起的。全球发病率在1‰左右,患儿出生后常伴有进食、语言、听力和牙齿发育等功能障碍,需要进行多次手术治疗。目前,疾病诊断主要依靠孕中晚期胎儿超声检查,而此时畸形已经完全形成,失去最佳干预和治疗时机。而且超声检查结果易受到孕妇肥胖、胎位和医师经验等因素的干扰,使其无法准确诊断。唇腭裂的发生和环境、基因因素以及环境和基因的交互作用均相关。目前有关人类ns CLP的发病机制研究较少。因此早期无创的产前诊断分子标志物筛选和相关致病机制研究尤为重要。本研究对孕有ns CLP胎儿孕妇的血浆、白细胞、血浆来源的外泌体及ns CLP胎儿唇部组织分别进行转录组学分析,旨在筛查出ns CLP相关的产前诊断分子标志物,并以此为依据进一步研究发病机制,为ns CLP的产前诊断优化和早期治疗干预提供实验依据。研究方法:1、本研究第一部分通过孕妇血浆和血浆来源的外泌体小RNA测序分析结果,联合生物信息学软件分析和实验验证,对PIWI-interacting RNAs(pi RNAs)和micro RNAs(mi RNAs)作为ns CLP的早期无创产前诊断分子标志物的诊断能力进行探讨。1.1从正在开展中的盛京出生队列项目中纳入研究标本,对血浆来源的外泌体开展转录组学测序分析。应用生物信息学分析软件和real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(q RT-PCR)方法筛选血浆来源的外泌体中的差异表达的pi RNAs。1.2应用受试者工作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲线分析差异表达的hsa-pi R-009228、hsa-pi R-016659和hsa-pi R-020496作为潜在分子标志物诊断ns CLP的能力。1.3q RT-PCR方法检测hsa-pi R-009228、hsa-pi R-016659和hsa-pi R-020496在正常足月分娩的孕妇产前和产后24h的血浆来源的外泌体中的表达水平,并在同一孕妇不同妊娠阶段的连续8个时间点检测其时空表达规律。1.4 q RT-PCR方法检测以上3个pi RNAs在孕妇血浆、脐带、胎盘、胎儿小腿内侧肌肉和唇部组织中的表达水平。1.5应用q RT-PCR方法和ROC曲线分析以上3个pi RNAs在其他常见出生缺陷疾病(脊柱裂和先心病)中的表达水平和诊断能力。1.6应用q RT-PCR方法和ROC曲线分析检测以上3个pi RNAs在孕早期(15-19周)孕有ns CLP胎儿孕妇血浆来源的外泌体中的表达水平和诊断能力。1.7从正在开展中的盛京出生队列项目中纳入研究标本,对血浆和血浆来源的外泌体开展转录组学测序分析。应用生物信息学软件分析差异表达的mi RNAs。1.8 q RT-PCR方法检测Let-7家族中的8个mi RNAs(hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-mi R-98-5p)在血浆和血浆来源的外泌体中的表达水平。1.9应用ROC曲线分析Let-7家族中的8个mi RNAs作为产前分子标志物诊断ns CLP疾病的能力。2、第二部分通过对ns CLP胎儿和健康胎儿的唇部组织开展转录组学测序分析,验证了EN2、LIN28A、hsa-let-7a-3p、HHIP和GLI2在唇腭裂胎儿唇部组织中的表达水平及对人口腔角质上皮细胞(Human oral keratinocytes,HOK)增殖作用的影响。探讨了以上基因构成的分子调控网络在调节唇腭裂发生中的作用与机制。2.1应用q RT-PCR和Western blot方法检测EN2、LIN28A、hsa-let-7a-3p、HHIP和GLI2在胎儿唇部组织中的内源性表达水平。2.2培养HOK细胞和人胚肾细胞(Human embryonic kidney 293T,HEK-293T)。2.3通过双荧光素酶报告基因实验检测hsa-let-7a-3p与HHIP的结合作用和结合位点。2.4通过瞬时转染构建hsa-let-7a-3p表达沉默/过表达的HOK细胞系,使用q RT-PCR和Western blot方法检测靶基因HHIP和GLI2的变化水平,应用CCK-8实验检测细胞增殖能力。2.5应用免疫共沉淀法实验(Ch IP)和荧光素酶报告基因实验明确EN2和LIN28A启动子区的结合作用和结合位点,之后在HOK细胞中进一步明确EN2能够转录激活LIN28A表达。2.6通过细胞转染方法构建EN2、LIN28A和HHIP稳定表达沉默的HOK细胞系。q RT-PCR实验检测EN2、LIN28A、hsa-let-7a-3p、HHIP和GLI2的RNA表达水平;Western blot方法检测EN2、LIN28A、HHIP和GLI2的蛋白表达水平。应用CCK-8实验检测细胞增殖能力。结果:1、孕妇血浆及血浆来源的外泌体中pi RNAs和mi RNAs有望成为诊断ns CLP的产前诊断分子标志物。1.1 hsa-pi R-009228、hsa-pi R-016659和hsa-pi R-020496在孕有ns CLP胎儿的孕妇血浆来源的外泌体中显著低表达。1.2hsa-pi R-009228、hsa-pi R-016659和hsa-pi R-020496在ns CLP的产前诊断中具有较好的诊断能力。1.3以上3个pi RNAs在正常妊娠阶段不同孕周呈规律性变化趋势,孕4-5周表达水平升高,至8-9周唇腭发育期达到顶峰,随后开始降低,直至分娩后。1.4 hsa-pi R-009228和hsa-pi R-020496在孕有ns CLP胎儿的孕妇血浆、脐带、胎盘和唇腭裂胎儿小腿内侧肌肉中表达水平无显著变化,在唇腭裂胎儿唇部组织中显著低表达。hsa-pi R-016659在孕有ns CLP胎儿的孕妇血浆中低表达。1.5 hsa-pi R-009228、hsa-pi R-016659和hsa-pi R-020496在孕有脊柱裂胎儿的孕妇血浆来源的外泌体中显著低表达,具有较好的产前诊断能力。hsa-pi R-009228在孕有先心病的孕妇血浆来源的外泌体中低表达,而hsa-pi R-016659高表达,均具有诊断先心病的能力。1.6相比较于24周左右的孕妇血浆来源的外泌体,hsa-pi R-009228、hsa-pi R-016659和hsa-pi R-020496在孕早期(15-19周)对ns CLP的诊断效果更好。1.7 Let-7家族中的8个mi RNAs(hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-mi R-98-5p)在孕有ns CLP胎儿的孕妇全血浆和血浆来源的外泌体中均显著低表达。1.8外泌体中差异表达的8个mi RNAs的诊断效率要优于血浆中的诊断效率,其中外泌体中8个mi RNAs的联合诊断分析,ROC曲线下面积为0.992,灵敏度为100%,特异度为93.3%。2、筛选潜在的ns CLP致病基因并构建EN2/LIN28A/hsa-let-7a-3p/HHIP/GLI2调控轴。2.1生物信息学分析筛选潜在的可能致病基因,扩大样本验证后得出,EN2、LIN28A和HHIP基因在病变部位中高表达;而hsa-let-7a-3p和GLI2基因在病变部位中低表达。2.2 HHIP是hsa-let-7a-3p的潜在靶基因,且二者之间的相互作用是通过存在于HHIP m RNA的3’端非翻译区上的结合位点实现的。2.3当过表达hsa-let-7a-3p时,HHIP的m RNA和蛋白表达水平降低,GLI2的m RNA和蛋白表达水平升高,促进HOK细胞增殖;当抑制hsa-let-7a-3p时,HHIP的m RNA和蛋白表达水平升高,GLI2的m RNA和蛋白表达水平降低,抑制HOK细胞增殖。2.4 EN2靶向结合LIN28A启动子区,起到转录激活作用。2.5沉默HHIP后促进GLI2表达,促进HOK细胞增殖。沉默LIN28A解除对hsa-let-7a-3p的抑制表达作用,hsa-let-7a-3p表达升高,HHIP表达水平降低,GLI2表达水平升高,促进HOK细胞增殖。沉默EN2后LIN28A和HHIP表达降低,hsa-let-7a-3p和GLI2表达水平升高,促进HOK细胞增殖。结论:1、外泌体中差异表达的3个pi RNAs(hsa-pi R-009228、hsa-pi R-016659和hsa-pi R-020496)可能具有作为筛查ns CLP和脊柱裂的产前诊断分子标志物的潜力。2、外泌体中差异表达的hsa-pi R-009228和hsa-pi R-016659有望成为筛查先心病的产前诊断分子标志物。3、血浆及血浆来源的外泌体中差异表达的8个mi RNAs(hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-mi R-98-5p)具有潜力可能作为ns CLP的产前诊断分子标志物。4、HHIP是hsa-let-7a-3p的新靶点,并通过位于HHIP m RNA 3’端非翻译区的结合位点与hsa-let-7a-3p相互作用。5、EN2与LIN28A的启动子区直接结合,促进其转录,发挥抑制HOK细胞增殖的作用。6、EN2/LIN28A/hsa-let-7a-3p/HHIP/GLI2调控通路在唇腭裂发育过程中起到重要作用。本研究不仅为非综合征型唇腭裂的产前诊断提供了潜在的具有临床应用价值的分子标志物,而且发现了导致非综合征型唇腭裂疾病发生的新的潜在分子机制。