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第一部分电针对脑缺血大鼠学习记忆功能障碍的作用及PKA/CREB信号通路的影响目的:研究电针对脑缺血大鼠空间学习记忆和长时程增强(long-term potentiation,LTP)的作用,并探讨其对海马区蛋白激酶A-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白信号通路(cAMP-dependent protein kinase-cyclic adenosine monophosphate response element binding protein,PKA/CREB)的影响。方法:50只雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham-operated control group)、模型组(model group)、电针组(EA group)、电针 +H89组(EA+H89 group,N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide · 2HC1 hydrate,H89)和电针+NS组(EA+NS group)。制备双侧颈总动脉永久性结扎(two-vessel occlusion,2VO)模型。电针百会穴(GV20)和大椎穴(GV14),连续治疗7d。治疗结束后,通过Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)检测大鼠的空间学习记忆能力,在体记录海马Schaffer侧支-CAl通路的LTP现象,并通过免疫蛋白印迹法(westernblot)检测海马区磷酸化CREB(phosphoCREB,pCREB)蛋白的表达量。结果:1.Morris水迷宫实验中:与假手术组相比,模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.05)而在目标象限的停留时间显著减少(P<0.01);与模型组相比,电针组大鼠的逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)而在目标象限的停留时间显著增加(P<0.01);电针+H89组较电针+NS组的大鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.05),而在目标象限的停留时间显著减少(P<0.01)。2.在体LTP检测中:对HFS刺激后60min时间段大鼠海马Schaffer侧支-CAl通路fEPSP波幅相对斜率进行统计学分析,与假手术组相比,模型组的fEPSP波幅相对斜率均显著下降(P<0.01),而电针组较模型组的fEPSP波幅相对斜率均显著升高(P<0.01);电针+H89组的fEPSP波幅相对斜率较电针+NS组均显著下降(P<0.01)。3.Western blot实验中:模型组较假手术组大鼠海马区的pCREB蛋白量显著降低(P<0.01),而电针组较模型组大鼠海马区的pCREB蛋白量显著增加(P<0.05);电针+H89组较电针+NS组大鼠海马区的pCREB蛋白量显著降低(P<0.05)。结论:1.电针百会穴和大椎穴可改善脑缺血大鼠的空间学习记忆功能下降和LTP受损。2.脑缺血大鼠海马区pCREB蛋白表达下降,而电针可抑制脑缺血大鼠海马区pCREB蛋白表达量的下降,提示电针的作用可能与影响pCREB蛋白的表达相关。3.给予H89阻断PKA后,电针的上述作用均被抑制,进一步验证了电针的作用可能与PKA/CREB信号通路相关。第二部分电针激活PKA/CREB信号通路对脑缺血大鼠海马神经元凋亡的作用及机制研究目的:设置7d、14d、21d三个时间点,研究电针对脑缺血大鼠海马神经元凋亡的作用及对PKA/CREB信号通路中凋亡相关基因Bax和Bcl-2的影响。方法:120只雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham-operated control group)、模型组(model group)、电针组(EA group)、电针+H89 组(EA+H89 group)和电针+NS 组(EA+NS group),每组又分为7d、14d、21d三个亚组。制备双侧颈总动脉永久性结扎(two-vessel occlusion,2VO)模型。电针百会穴(GV20)和大椎穴(GV14)。在7d、14d、21d 后,通过 TUNEL 法(TdT-mediateddUTPnick endlabeling)和免疫蛋白印迹法(westernblot)观测海马神经元凋亡水平及Bax蛋白、Bcl-2蛋白表达量。结果:1.TUNEL染色发现:(1)随着观察时间延长,模型组14d组、21d组较7d组显著增加(P<0.05);电针组在7d、14d、21d三个时间点海马神经元凋亡率呈逐渐增加趋势,但三个亚组间无显著统计学差异(P>0.05);其余各组的三个亚组间海马神经元凋亡率未见显著的统计学差异(P>0.05)。(2)同时间点各组大鼠间的海马神经元凋亡率相比,在7d、14d和21d,模型组较假手术组均显著增加(P<0.05);电针组较模型组均显著降低(P<0.05);电针＋H89组较电针+NS组均显著增多(P<0.05)。2.Western blot实验中:(1)随着观察时间延长,电针组21d组较14d组Bcl-2蛋白量显著增多(P<0.05);其余各组的三个亚组相比,Bax蛋白和Bcl-2蛋白的相对表达量未见显著的统计学差异(P>0.05)。(2)同时间点各组大鼠间的凋亡相关蛋白表达量相比,在7d、14d和21d,模型组较假手术组Bax蛋白量均显著增高(P<0.05),而Bcl-2蛋白量均显著降低(P<0.05);电针组较模型组Bax蛋白量均显著降低(P<0.05),而Bcl-2蛋白量均显著增加(P<0.05);电针+H89组较电针+NS组Bax蛋白量均明显增多(P<0.05),而Bcl-2蛋白量明显降低(P<0.05),但在14d时两组Bcl-2蛋白表达差异无显著统计学意义(P>0.05)。结论:1.电针治疗7d、14d和21d时均可显著减轻脑缺血大鼠的海马神经元凋亡。2.电针的作用可能与调控Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表达相关。3.给予H89阻断PKA后,电针的上述作用均被抑制,进一步验证了电针可能通过激活PKA/CREB信号通路发挥抗神经元凋亡的作用。第三部分电针激活PKA/CREB信号通路对脑缺血大鼠海马突触可塑性的作用及机制研究目的:设置7d、14d和21d三个时间点,观察电针对海马CA1区锥体神经元树突棘密度的影响及对PKA/CREB信号通路中相关靶基因的调控作用。方法:首先将30只大鼠随机分为假手术组(sham-operated control group)、模型组(model group)、电针组(EAgroup)、电针+H89 组(EA+H89 group)和电针+NS 组(EA+NS group),7d后采用高尔基染色(Golgi染色)观察各组大鼠海马CAl区锥体神经元树突棘密度,每组6只大鼠。然后将另外75只大鼠随机分成同上的5个组,并根据观察时间每组又分成7d、14d和21d三个亚组,每组5只大鼠,新鲜取材后采用实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)检测海马 microRNA132(miR132)的表达,及采用蛋白免疫印迹(westernblot)法检测海马区pCREB蛋白、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和 p250GAP 蛋白(GTP酶活化蛋白)的表达。永久性结扎双侧颈总动脉(two-vessel occlusion,2VO)制备脑缺血模型。术后第二天开始在百会穴(GV20)和大椎穴(GV14)施以电针治疗。结果:1.树突棘密度比较:在7d时,模型组较假手术组均显著下降(P<0.01),而电针组较模型组均显著增高(P<0.01),电针+H89组较电针＋NS组均显著降低(P<0.01)。2.pCREB蛋白表达量比较:在7d、14d和21d,模型组较假手术组均显著下降(P<0.05)且电针组较模型组均显著增多(P<0.05);在7d和14d,电针+H89组较电针+NS组均明显下降(P<0.05),但在21d时两组pCREB蛋白表达量差异无显著统计学意义(P>0.05)。3.BDNF蛋白表达量比较:在7d、14d和21d,模型组较假手术组均显著下降(P<0.05);7d和21d时电针组较模型组均显著增多(P<0.05),但在14d时电针组和模型组差异无显著统计学意义(P>0.05);在7d、14d和21d,电针+H89组较电针＋NS组均明显下降(P<0.05)。4.p250GAP蛋白表达量比较:在7d、14d和21d,模型组较假手术组均显著增加(P<0.05)且电针组较模型组均显著降低(P<0.05);在7d时,电针+H89组较电针+NS组均明显升高(P<0.05),但在14d和21d,p250GAP蛋白表达量差异无显著统计学意义(P>0.05)。5.miR132表达量比较:在7d、14d和21d,模型组较假手术组均显著下降(P<0.05),电针组较模型组均显著增多(P<0.05),电针+H89组较电针＋ NS组均显著下降(P<0.05)。结论:1.电针作用7d时可减轻脑缺血大鼠海马神经元树突棘密度的下降,促进突触可塑性。2.电针可以激活PKA/CREB信号通路调控pCREB蛋白、BDNF蛋白、miR132及p250GAP蛋白的表达。3.给予H89阻断PKA后,电针的上述作用被抑制,进一步验证了电针可能通过激活PKA/CREB信号通路发挥作用。