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目的:
本实验从组织、细胞、亚细胞水平和蛋白水平,观察新型甲型H1N1流感病毒感染后受损伤的器官;研究重症死亡病例各个器官的病理学变化特征;分析病毒抗原、CD68及细胞因子TGF-β在各器官中的分布特点,进一步探索重症死亡病例可能的发病机制。
材料和方法:
收集2009年北京甲型H1N1流感重症死亡病例8例,2例进行系统尸体解剖,6例床旁穿刺获得肺脏、心脏、肝脏、脾脏各个器官的标本,并分别冻存、固定。
1、通过HE染色观察气管、肺、心脏、肝脏、肾脏、脑、脾脏和淋巴结、的病理变化,并通过脂肪染色进一步观察妊娠病例肝脏变化;
2、电镜观察肺内病毒颗粒的情况;
3、免疫组织化学技术检测各个器官的病毒抗原及CD68和细胞因子TGF-β的改变;
4、蛋白印迹法(westernblot)检测肺、心、肝、肾、脑、脾组织中病毒核蛋白(NP)的表达:
5、原位杂交技术检测各器官病毒核酸的情况;
6、流式细胞术检测肺泡上皮的凋亡情况。
研究结果:
1、新型甲型H1N1流感重症患者病理变化累及多个器官:主要病理变化为坏死性支气管炎和周围炎;弥漫性肺损伤和肺出血及纤维化,流式细胞术检测Ⅱ型肺泡上皮的凋亡率明显高于对照组;心肌问质局灶性淋巴细胞浸润,部分心肌肌浆凝聚;肝内细胞带状坏死,妊娠女性肝细胞可见微泡型脂肪变,汇管区可见少量淋巴细胞浸润;脾脏内脾小体萎缩,淋巴细胞转化不明显,嗜红细胞现象明显;淋巴结内淋巴细胞减少,滤泡及生发中心不明显,可见嗜红细胞现象;肾小球增大、毛细血管球淤血、通透性增加,肾小管灶性坏死,间质淋巴细胞浸润;脑内除血管扩张、血管间隙增大等脑水肿病变外,无其他明显病理变化。
2、多器官内可检测到病毒:免疫组化于肺、心、肝、肾内检测到病毒HA和NP抗原。其肺泡中阳性表达物可见于气管上皮、鳞状化生的上皮、部分肺泡上皮、肺内巨噬细胞;心脏内部分心肌细胞、问质血管内皮内可见阳性表达:肝脏阳性表达物位于坏死区的巨噬细胞内;肾脏主要见于部分肾小球囊壁内及球形小体中、坏死的肾小管上皮细胞内:脾脏未见明显阳性表达产物。Wegtem-blot法检测结果显示心、肝、脾、肺、肾内有病毒抗原NP的表达。电镜下,肺泡上皮细胞、血管内皮细胞可见病毒样颗粒;原位杂交示在气管中有病毒RNA的存在。
3、CD68及细胞因子TGF-β表达改变:CD68主要表达于单核巨噬细胞胞浆内。肺泡腔内可见阳性表达物;心脏中阳性表达物主要见于心肌间质、血管周围,妊娠病例中间质水肿区阳性物增多,并呈灶状分布;肝血窦内巨噬细胞肥大增生,CD68呈阳性表达;脾脏红髓内、淋巴结边缘窦内有强阳性表达物,肾脏CD68阴性。TGF-β表达部位:肺内可见于巨噬细胞、肺泡上皮、内皮细胞内;心脏阳性表达物见于血管内皮细胞、心肌间质巨噬细胞、血液中的单核细胞;肝脏坏死区内、脾巨噬细胞内、淋巴结中的巨噬细胞和边缘窦内可见阳性物;肾脏阳性表达物见于血管内皮和巨噬细胞内。实验组肺、肝、脾、淋巴结内TGF-β阳性率明显高于对照组。
研究结论:
新型甲型H1N1流感重症患者病理变化不但局限于呼吸道,其他各个器官均有不同程度的变化。坏死性支气管炎、弥漫性肺泡损伤、肺出血和晚期肺纤维化是重症患者主要的病理改变。其中气管损伤可能是病毒直接作用的结果,其他器官损伤可能与巨噬细胞和细胞因子TGF-β的作用密切相关。