本研究拟进行以下四个方面的研究：(1)探讨脊髓小胶质细胞p38MAPK在吗啡耐受中的作用是否受nNOS调制；(2)探讨脊髓星型胶质细胞JNK在吗啡耐受中的作用；(3)探讨脊髓星型胶质细胞JNK在吗啡耐受中的作用是否受NMDA受体调制；(4)以各种细胞为研究对象，首先比较神经元和胶质细胞在ATP代谢中的作用，再进一步明确各种胶质细胞在ATP代谢的每个过程中所发挥的具体作用。探讨正常情况下不同胶质细胞在ATP代谢中的具体作用，有助于进一步探讨胶质细胞及ATP与其代谢物在吗啡耐受或其他病理情况中的作用。 第一章脊髓小胶质细胞p38MAPK在nNOS介导的吗啡耐受中的作用 为了探讨脊髓小胶质细胞p38MAPK在吗啡耐受中的作用是否受nNOS的调制，本实验使用了nNOS的特异性抑制剂7-NINA。实验中通过对SD大鼠连续7天鞘内注射吗啡15μg建立吗啡耐受的动物模型，用50℃热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果。结果显示，慢性鞘内注射吗啡7天后，吗啡镇痛作用明显下降，表明吗啡耐受的形成；7-NINA(25μg)本身对痛阈无影响，但联合应用7-NINA和吗啡，能够延缓吗啡耐受的形成。结果提示nNOS包括其产生的NO参与形成吗啡耐受。 为了证实我们的设想，用免疫组织化学染色观察脊髓小胶质细胞的标记物OX-42和磷酸化p38(p-p38)的表达。结果显示，吗啡耐受组脊髓OX-42表达明显上调，而且小胶质细胞的胞体变圆，突起变粗，成"阿米巴"状，提示慢性吗啡处理能激活脊髓小胶质细胞；而联合应用7-NINA和吗啡后，OX-42的表达受到了抑制，形态改变也较单纯吗啡组减轻，提示nNOS可能介导慢性吗啡处理对脊髓小胶质细胞的激活。同时，p-p38免疫染色结果表明，吗啡耐受导致的p-p38只存在于小胶质细胞，而且7-NINA+吗啡组的p-p38阳性细胞数量较单纯吗啡组明显减少，提示7-NINA抑制了脊髓小胶质细胞内p-p38的表达。值得注意的是nNOS只存在于神经元，OX-42是小胶质细胞的标记物，p-p38特异性地表达于小胶质细胞，提示在吗啡耐受的形成过程中，神经元nNOS不仅可以激活脊髓小胶质细胞，还可以激活小胶质细胞内的p38，从而表明了神经元和小胶质细胞之间可能存在信息交流，p38MAPK可能在脊髓nNOS介导的吗啡吗啡镇痛耐受中起着重要的作用。这是一种新见解。 第二章脊髓星型胶质细胞JNK在吗啡耐受中的作用 为了探讨脊髓JNK在吗啡耐受中的作用，本试验通过对SD大鼠连续7天鞘内注射吗啡15μg建立吗啡耐受的动物模型，免疫组织化学方法检测吗啡耐受过程中pJNK的表达情况。结果表明，慢性鞘内注射吗啡的过程中，免疫组织化学染色显示脊髓背角pJNK的表达随着吗啡耐受程度的增加而逐步增加。免疫荧光双染表明pJNK主要存在于脊髓星型胶质细胞。提示在吗啡耐受过程中星型胶质细胞中的JNK被激活。 为研究pJNK在吗啡镇痛耐受中的作用，在每次吗啡注射前15分钟鞘内给予JNK特异性抑制剂SP600125(25μg)，连续7天。采用50℃热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果。结果表明，SP600125本身对痛阈无影响，但与吗啡合用可以明显抑制吗啡镇痛耐受的形成，提示脊髓星型胶质细胞JNK介导吗啡镇痛耐受的形成。为观察SP600125能否拮抗早期形成的吗啡耐受，于吗啡耐受诱导后第4天开始给予SP60012525μg，15分钟后注射吗啡，连续注射4天。实验结果表明，在耐受早期，SP600125仍可以抑制其进一步形成：与吗啡耐受组相比，于注射吗啡第7天，在SP600125+吗啡组，吗啡仍可以产生明显的镇痛作用。为了进一步观察SP600125是否可以逆转已经形成的吗啡耐受，我们于鞘内注射吗啡的第8天开始注射SP600125，连续注射4天，结果发现SP600125仍然能使吗啡恢复部分镇痛作用。上述结果提示脊髓星型胶质细胞JNK的激活参与了吗啡耐受的发生和维持，在吗啡耐受的后期也发挥了重要的作用。本文为深入阐明脊髓星型胶质细胞JNK在吗啡镇痛耐受中的作用提供了新颖的实验依据，也为防治吗啡耐受提供了新的作用靶点。 第三章脊髓星型胶质细胞JNK在MK801抗吗啡耐受中的作用 为了探讨吗啡耐受过程中脊髓星型胶质细胞JNK是否受NMDA受体调制，我们使用了NMDA受体拮抗剂MK801。在实验中，通过对SD大鼠连续7天鞘内注射吗啡15μg建立吗啡耐受的动物模型，用50℃热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果。结果显示，慢性鞘内注射吗啡7天后，吗啡镇痛作用明显下降，表明吗啡耐受的形成；鞘内注射NMDA受体非竞争性拮抗剂MK801(3.3μg)本身对痛阈无影响，但与吗啡合用具有显著的抗吗啡耐受作用。从而证实了MK801能拮抗吗啡耐受NMDA受体介导吗啡镇痛耐受。 为了观察MK801对吗啡耐受过程中被激活的的脊髓星型胶质细胞及其pJNK的影响，免疫组织化学方法检测星型胶质细胞特异性标记物GFAP和pJNK表达情况。结果表明，吗啡耐受组脊髓背角GFAP明显上调，而且星型胶质细胞胞体变大，突起变粗，提示慢性吗啡处理能激活脊髓星型胶质细胞；持续7天鞘内注射MK801可以显著抑制慢性应用吗啡所诱导的星型胶质细胞GFAP的上调，形态改变也较单纯吗啡组减轻。同时，MK801+吗啡组脊髓星型胶质细胞pJNK阳性细胞数较单纯吗啡组明显下降。提示NMDA受体拮抗剂MK801可以通过抑制脊髓星型胶质细胞及其JNK的激活而发挥其抗吗啡耐受作用。本文为深入阐明MK801的抗吗啡镇痛耐受机制提供了新颖的实验资料，并提示在吗啡镇痛耐受中，胶质细胞及其JNK的激活是NMDA受体依赖的。 第四章胶质细胞在ATP代谢中的作用 本研究体外培养各种神经细胞，包括神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞，采用生物荧光ATP试剂盒(bioluminescent ATP assay kit)和Chrono—log照度计(Chrono—log luminometer)检测ATP的释放量，共聚焦显微镜观察100μM ATP刺激对各种细胞产生钙波的影响。结果显示，相对于神经元和小胶质细胞，星型胶质细胞是最主要的ATP释放细胞；而且相同浓度ATP刺激下星型胶质细胞产生的钙波最强，小胶质细胞次之，神经元最少。提示胶质细胞是释放ATP和产生钙波的主要细胞，其中星型胶质细胞的作用最大。 为了进一步研究释放出来的ATP在各种细胞的降解情况，500μM ATP和500μM AMP分别孵育各种细胞30分钟后，采用malachite green assay检测反应中产生的磷酸根(Pi)推测ATP/AMP降解总量，高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)检测孵育后的各种代谢成分。结果表明，ATP孵育30分钟后，星型胶质细胞分解ATP的总量最多，小胶质细胞次之，神经元最少；分析各种代谢成分，提示星型胶质细胞分解ATP生成ADP的能力很强，小胶质细胞分解ADP生成AMP的能力很强。AMP孵育30分钟后，少突胶质细胞分解AMP的总量最多，星型胶质细胞次之；分析各种代谢成分，提示少突胶质细胞生成腺苷的能力最强，星型胶质细胞生成肌苷的能力最强，另外星型胶质细胞还能生成IMP。提示胶质细胞在ATP的降解过程中发挥了主要作用，其中因此，从某种程度上讲，ATP的代谢是各种嘌呤类分子在胶质细胞之间传递的过程。我们若想利用某种分子，就可以以某种特定胶质细胞为切入点，增强生成该分子的细胞功能，或破坏分解该分子的细胞功能，使特定分子在特定情况下最大程度的发挥有利作用。上述研究为进一步探讨胶质细胞及ATP与其代谢物在吗啡耐受或其他病理情况中的作用提供了新思路。 结论： 1.本文首次提出，nNOS特异性抑制剂7-NINA能显著地抑制脊髓小胶质细胞OX—42和p—p38的表达，提示nNOS可能是吗啡耐受过程中激活小胶质细胞及其p38MAPK途径的机制之一，从而表明了神经元和小胶质细胞之间可能存在信息交流； 2.慢性鞘内注射吗啡可激活脊髓背角星型胶质细胞JNK的表达；脊髓星型胶质细胞JNK参与了吗啡耐受的形成和维持； 3.首次证实，NMDA受体抑制剂MK801能显著地抑制吗啡耐受诱导的星型胶质细胞GFAP和pJNK的表达，提示NMDA受体可能是吗啡耐受过程中激活星型胶质细胞及pJNK途径的机制之一； 4.本文首先提出，正常情况下，胶质细胞是释放ATP和形成钙波的主要细胞，而且主要是星型胶质细胞的作用； 5.首次证实，胶质细胞是分解ATP的主要细胞，其中星型胶质细胞是分解ATP为ADP的主要细胞，小胶质细胞是分解ADP为AMP的主要细胞，少突胶质细胞是分解AMP为腺苷的主要细胞，星型胶质细胞是生成肌苷和IMP的主要细胞。