目的：肝细胞癌的发病率高、预后差，近年肝细胞癌的发病率及病死率逐渐上升，其致病原因及发病机制尚未完全明确。随着分子生物学的发展及基因检测技术的进步，我们对抑癌基因的甲基化在肿瘤形成与发展中的作用越来越重视。具有泛素连接酶活性的环指蛋白能够通过调节靶蛋白底物的泛素化而在细胞生长及发育过程中发挥作用，其中环指蛋白180（the ring finger protein, RNF180）是一种膜结合的E3泛素连接酶，包含RING finger结构域，富含半胱氨酸/组氨酸（C3HC4）。RNF180基因是一个新发现的抑癌基因，有报道认为RNF180基因DNA启动子区域高甲基化在胃癌发生、发展中具有重要的作用，是胃癌患者的潜在临床生物学指标。虽然已证实RNF180基因DNA甲基化与胃癌的发生有关，但该基因与其他肿瘤性疾病的关系尚未见报道，因此本实验欲研究RNF180基因DNA启动子区域甲基化与肝细胞癌发癌风险的关系，该研究以新鲜肝脏组织为标本，采用甲基化特异性聚合酶链反应（Methylation Specific PCR,MSP）及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测RNF180基因DNA启动子区域的甲基化状态及其mRNA表达情况，分析该基因与临床特征、病理学特征及生存期预后的关系，为抑癌基因RNF180DNA启动子区域甲基化检测的临床应用提供理论依据，阐明RNF180基因DNA启动子区域甲基化在肝细胞癌发生、发展中的作用，进一步完善甲基化修饰的抑癌基因谱，为RING-finger家族蛋白泛素E3酶的生物学功能提供新的实验证据。方法：1研究资料：收集2010年4月～2011年12月河北医科大学第四医院肝胆外科行手术切除的肝细胞癌的病例50例、对应癌旁肝硬化的病例50例、正常肝脏组织的病例5例。本实验研究对象男性45例，女性5例，年龄在36～78岁，中位年龄为55.00±8.86岁。肿瘤直径0.5～25cm。本组患者中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性41例，阴性9例；丙型肝炎抗体（HCV-Ab）均为阴性。患者随访截止至2012年3月。所有实验对象在行手术切除之前均没有进行过化疗或放疗。标本切除后立即保存于液氮中后保存于-80℃冰箱备用。所有标本常规石蜡包埋，HE染色，最后由2名病理科医师诊断证实为肝细胞癌、肝硬化及正常肝脏组织。搜集患者吸烟史、饮酒史、肝炎病史、家族史等病史，登记患者血常规、凝血功能、肝功能、AFP等实验室资料，记录患者肿瘤大小、个数、是否合并瘤栓及病理分化程度等病理学资料。通过电话联系或信访的方式对患者进行随访。2抑癌基因RNF180DNA启动子区域甲基化检测方法：新鲜肝组织genomicDNA采用传统的酚-氯仿方法提取，经过亚硫酸氢盐的处理后，用WizardDNA纯化试剂盒纯化genomicDNA，然后应用甲基化特异性PCR(MethylationSpecificPCR,MSP)技术对抑癌基因RNF180进行目的片段的扩增，扩增后的产物通过电泳凝胶成像系统进行甲基化结果的分析判定。RNF180基因的DNA甲基化上游引物为：5’-GACGTGGGGCGAGTAGGGTCGTT-3’，RNF180基因的DNA甲基化下游引物为：5’-CCGACCGAAACCAAATCCCTCCGAA-3’；RNF180基因的DNA非甲基化上游引物为：5’-GATGTGGGGTGAGTAGGGTTGTT-3’，RNF180基因的DNA非甲基化下游引物为：5’-CCAACCAAAACCAAATCCCTCCAAA-3’。3检测RNF180基因的mRNA表达情况：应用RNA提取试剂盒提取总RNA后，再用反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA，然后应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测mRNA的表达情况。4统计学分析：实验数据使用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用t检验或非参数检验，计数资料采用X2检验或Fisher确切概率法，生存分析采用Kaplan-Meier法计算，单因素分析采用Log-rank检验，多因素分析采用COX模型。以P＜0.05认为具有统计学意义。结果：1肝细胞癌、肝硬化及正常肝脏组织中RNF180基因DNA启动子区域甲基化表达及比较RNF180基因DNA在肝细胞癌组织、肝硬化组织中的甲基化率分别为60.00%（30/50）、30.00%（15/50），肝细胞癌病例组的甲基化率显著高于癌旁肝硬化病例组的甲基化率（X~2=9.091P=0.003），可以认为两组比较差异有统计学意义。而正常肝脏病例组中未发生RNF180基因DNA启动子区域的甲基化。2肝细胞癌患者中RNF180基因DNA启动子区域的甲基化状态与临床特征的比较RNF180基因DNA启动子区域甲基化阳性率与肝细胞癌的临床分期比较，I期肿瘤与II-III期肿瘤比较，I期肿瘤患者的甲基化率高于II-III期肿瘤患者的甲基化率（P=0.006），差异有统计学意义。RNF180基因DNA启动子区域的甲基化阳性率与患者的性别（P=1.000），年龄（P=0.470），HBsAg分组（P=0.724），肝功能Child-pugh分级（P=0.556），血清AFP值（P=0.083）的大小间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。3肝细胞癌患者中RNF180基因DNA启动子区域的甲基化与病理学特征的比较RNF180基因DNA启动子区域的甲基化阳性率与肝细胞癌的病理分化程度比较，高分化组与中-低分化组差异无统计学意义（P＞0.05）。与肿瘤的个数、肿瘤直径、有无门静脉瘤栓亦无关（P＞0.05）。4RNF180基因的mRNA表达与临床特征的关系肝细胞癌组织RNF180基因的mRNA呈低表达，相对平均表达量为0.306±0.219，肝硬化组织中该基因的mRNA呈高表达，相对平均表达量为0.539±0.270，差异具有统计学意义（F=4.42P=0.04）。存在mRNA表达的31例肝细胞癌组织中，mRNA在男性组、小于60岁组、Child A级组、表面抗原阴性组、直径小于5cm组、单发肿瘤组、无瘤栓组、临床分期II-III期组中高表达，但分别比较差异无统计学意义。5RNF180基因DNA启动子区域甲基化与RNF180基因的mRNA表达的关系在RNF180基因DNA启动子区域甲基化阳性的肝细胞癌组中，其mRNA相对平均表达量为0.317±0.233，呈低表达，甲基化阴性的肝细胞癌组中mRNA相对平均表达量为0.497±0.235呈高表达，二者差异有统计学意义（P=0.046）。6抑癌基因RNF180DNA启动子区域的甲基化与肝细胞癌患者生存期预后的关系对50例肝细胞癌患者进行电话或信访的方式随访其生存情况，随访截止时间为至2012年3月，随访时间3～23月，没有失访者。该组6个月、12个月、18个月生存率分别为86.0%、54.0%、36.0%。RNF180基因DNA启动子区域甲基化阳性的肝细胞癌患者6个月、12个月、18个月生存率分别为90.0%，53.3%，26.7%，中位生存时间为12个月，平均生存时间为12（11.25）个月；甲基化阴性者6个月、12个月、18个月生存率分别为80.0%，55.0%，45.0%，中位生存时间为15个月，平均生存时间为14.1±7.49个月。为分析与肝细胞癌患者总生存期有关的独立预后因素，选择年龄、性别、表面抗原、Child-pugh分级、血清AFP值、肿瘤大小、肿瘤个数、门脉瘤栓、有无转移、临床分期、病理分化程度及RNF180基因DNA启动子区域甲基化12个变量进行COX多因素分析，结果显示P值均大于0.05。对肝细胞癌患者分层分析，发现肝细胞癌患者临床分期为I期的病例中RNF180基因DNA甲基化阳性的生存率及甲基化阴性者的生存率均为100.0%，差异无统计学意义；而在II-III期的病例中RNF180基因DNA甲基化阳性的生存率为33.3%，甲基化阴性者的生存率为66.7%，差异有统计学意义（P=0.025）。结论：1RNF180基因在正常肝组织中未发生甲基化，而在肝细胞癌组甲基化率较肝硬化组高，提示抑癌基因RNF180基因DNA启动子区域高甲基化能促进肝硬化到肝细胞癌的发展进程。可能是导致肝细胞癌形成的原因之一。2RNF180基因DNA启动子区甲基化与肝细胞癌的临床分期有关，提示RNF180基因DNA启动子区域的高甲基化可能反映患者病情程度。3抑癌基因RNF180基因DNA启动子区域甲基化状态与晚期肝细胞癌的预后有关，可能作为晚期肝细胞癌预后预测的因子。