【摘 要】
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目的:1、评价mi R-338-5p在胶质瘤组织中的表达水平及其与胶质瘤患者临床病理特征之间的关系;2、探索mi R-338-5p在胶质瘤细胞中的作用,寻找其作用靶基因,为胶质瘤诊断和治疗研究提供新靶点;3、引入噬菌体展示肽库技术,筛选和鉴定具有靶向能力的高亲和特异性多肽;4、核素标记、合成探针,与荷瘤鼠中评价中选小肽的肿瘤靶向性。材料与方法:运用q RT-PCR的方法检测了胶质瘤及其正常脑组织标
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目的:1、评价mi R-338-5p在胶质瘤组织中的表达水平及其与胶质瘤患者临床病理特征之间的关系;2、探索mi R-338-5p在胶质瘤细胞中的作用,寻找其作用靶基因,为胶质瘤诊断和治疗研究提供新靶点;3、引入噬菌体展示肽库技术,筛选和鉴定具有靶向能力的高亲和特异性多肽;4、核素标记、合成探针,与荷瘤鼠中评价中选小肽的肿瘤靶向性。材料与方法:运用q RT-PCR的方法检测了胶质瘤及其正常脑组织标本中mi R-338-5p的表达;通过脂质体瞬时转染法,将mi R-338-5p mimics导入胶质瘤细胞T89G和U87中,提高内源性mi R-338-5p的表达后,使用CCK-8细胞增殖实验检测mi R-338-5p对胶质瘤细胞增殖能力的影响;利用生物信息学工具,预测了与mi R-338-5p作用的位点在CTBP2的3’UTR区域,利用荧光素酶报告基因实验证实该结合位点。通过CCK8实验和Transwell细胞侵袭实验探索CTBP2是否是mi R-338-5p的直接作用靶基因。通过对比CTBP2特定序列寻找CTBP2特异性亲和配体。获得特定序列后,将其列为靶分子特异性结合的肽段,用于筛选特异性噬菌体展示库。四轮筛选后获得的重组噬菌体克隆与CTBP2特异性短肽的结合活性在扩增噬菌斑进行DNA测序。噬菌体十二肽进行系列倍数稀释后,通过ELISA检测得到了一组与CTBP2特异序列肽高亲和力结合的噬菌体克隆,通过prism 4.0软件分析作图后测算解离常数（Kd值）。99mTc标记携带双功能鳌合剂HYNIC的CTBP2靶向中选小肽,通过采用TPPTS和tricine为协同配体,将核素标记药物用于胶质瘤小鼠模型的肿瘤显像,深入评价标记产物的肿瘤靶向结合能力。结果:MiR-338-5p在胶质瘤中的表达低于正常脑组织,并随着胶质瘤WHO分级级别增高,mi R-338-5p的表达呈降低趋势。另外,mi R-338-5p表达也与Karnofsky表现值有着显著的联系。我们通过脂质体瞬时转染法,将mi R-338-5p mimics导入胶质瘤细胞T89G和U87中,提高内源性mi R-338-5p的表达后,使用CCK-8细胞增殖实验检测mi R-338-5p对胶质瘤细胞增殖能力的影响,结果显示:与对照组相比,过表达mi R-338-5p后能显著抑制胶质瘤细胞的增殖。利用单染法流式细胞技术,我们发现过表达mi R-338-5p可以引起细胞G1期阻滞,抑制细胞增殖。利用生物信息学工具,我们预测了与mi R-338-5p作用的位点在CTBP2的3’UTR区域。荧光素酶报告基因实验结果显示共转染mi R-338-5p过表达载体质粒后,与对照组相比,CTBP2 3’UTR野生型组的荧光素酶的活性显著降低（P<0.05）。说明mi R-338-5p能与CTBP2 m RNA分子的3’UTR发生特异性结合。通过Western blot我们证实mi R-338-5p可以在蛋白水平调控CTBP2表达。而通过CCK8实验和Transwell细胞侵袭实验,我们发现转染mi R-338-5p抑制剂组的U87细胞在增殖和侵袭能力上明显高于其他两组,而si-CTBP2组与mi R-NC没有明显差别。以上的结果说明,CTBP2作为mi R-338-5p的直接靶基因,被其负调控,通过蛋白量的表达降低介导mi R-338-5p抑制肿瘤的增殖和侵袭。接下来,我们利用噬菌体展示肽库技术对靶向CTBP2蛋白的小肽筛选,得到了优选特异性亲和小肽TCB（VSKYHLHSRARL）。我们利用99mTc对TCB小肽进行标记,合成了显像分子探针99mTc-HYNIC-TCB,标记率达到95%。荷U87细胞胶质瘤裸鼠模型尾静脉注射99mTc-HYNIC-TCB 90分钟后,肿瘤显像清晰。同时,我们还获得了99mTc-HYNIC-TCB在荷U87细胞胶质瘤小鼠体内的生物分布的数据。结论:1、本研究证实了mi R-338-5p通过CTBP2蛋白发挥抑制胶质瘤增殖、侵袭作用的机制;2、通过噬菌体展示肽库技术,我们筛选出靶向CTBP2蛋白的特异性小肽TCB,并利用99mTc进行了核素标记;3、本研究成功利用99mTc-HYNIC-TCB进行了靶向胶质瘤CTBP2蛋白的SPECT显像,这将为胶质瘤诊断、治疗、及胶质瘤增殖、侵袭作用的机制研究提供更多的,更关键的信息。
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