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骨肉瘤是儿童和青少年群体中最常见的骨组织来源恶性肿瘤。自从二十世纪七十年代在临床应用新辅助化疗,骨肉瘤总体生存率大为提高。目前手术联合新辅助化疗是骨肉瘤的常规治疗策略,然而骨肉瘤化疗的临床疗效已经停滞不前近40年,在超过40%的骨肉瘤患者中化疗疗效不佳,患者出现复发或者远处转移,且没有其他有效的替代治疗手段,因此需要引入新的治疗方式并探索更有效的治疗策略。本研究旨在评估使用PD-L1抗体或者索拉菲尼阻断PD-L1,并且联合化疗治疗骨肉瘤的潜在价值。第一部分PD-L1抗体联合传统化疗增强了对于骨肉瘤的疗效本研究第一部分首先对化疗前后临床骨肉瘤组织标本进行免疫组织化学分析,结果表明骨肉瘤的常规化疗可以明显提高骨肉瘤组织中PD-L1的表达。接下来研究选取骨肉瘤化疗中具有代表性的药物阿霉素,通过Western Blot和流式细胞分析技术确定阿霉素单药也可以上调多种骨肉瘤细胞系中PD-L1的表达。然后通过在体外共培养淋巴细胞和骨肉瘤细胞的方式,同时使用流式细胞分析技术确定阿霉素处理之后骨肉瘤细胞表面PD-L1表达上升,从而促进了CD8+T细胞的凋亡并且抑制其增殖,此外还影响了淋巴细胞分泌细胞因子从而抑制了免疫系统抗肿瘤的作用。最后在动物实验中,PD-L1抗体联合阿霉素展现出了对于骨肉瘤非常好的治疗效果,进一步通过流式分析发现两药联用组骨肉瘤细胞膜表面PD-L1的表达可以被抗体有效阻断,从而有效提高了抗肿瘤细胞免疫的应答。总体而言,本研究证明了使用PD-L1抗体阻断PD-L1联合化疗具有潜在的治疗骨肉瘤的临床价值。第二部分索拉菲尼联合传统化疗治疗骨肉瘤的临床前研究本研究继第一部分研究之后,结合既往研究结果并进一步探索提示化疗药物可能可以通过ERK通路上调恶性肿瘤PD-L1的表达。由于骨肉瘤二线药物多靶点抑制剂索拉菲尼具有ERK通路阻断作用,同时PD-L1抗体只能阻断骨肉瘤细胞膜表面的PD-L1,而不能影响细胞内PD-L1的变化,通过通路调节既可以影响细胞膜表面PD-L1的表达也可以调节骨肉瘤细胞内PD-L1的变化,因此使用索拉菲尼阻断化疗引起的PD-L1上调可能具有更好的临床应用价值。基于这个原因我们进一步探究索拉菲尼联合化疗是否也能起到阻断PD-L1上调的效果。在体外实验中我们通过Western Blot,RT-PCR,流式细胞检测技术发现联合应用索拉菲尼可以有效阻止阿霉素介导的骨肉瘤细胞膜以及细胞总PD-L1的上调,接下来我们通过Western Blot检测发现在阿霉素与索拉菲尼处理过程中,ERK通路变化与骨肉瘤PD-L1调节呈现高度一致性,我们应用ERK通路抑制剂联合阿霉素也起到了与索拉菲尼相同的PD-L1抑制的作用。最后研究通过动物实验结合免疫组织化学以及流式细胞分析技术确定阿霉素和索拉菲尼联用相对于阿霉素单药处理,其骨肉瘤组织中PD-L1表达确实明显下降,并且引起了更强的抗肿瘤细胞免疫反应。总之,我们的研究表明,骨肉瘤临床治疗药物索拉菲尼可以通过抑制ERK通路抑制骨肉瘤化疗诱导的骨肉瘤PD-L1上调,并且具有与骨肉瘤化疗联合应用的潜在价值。