卵巢癌（Ovarian cancer）作为妇科常见的恶性肿瘤,发病率及病死率均居前列,对女性的生命健康造成严重威胁,由于其发病隐蔽的特点,让许多患者在临床症状出现后进行诊断时已是晚期,这在一定程度造成了患者总体的生存率较低。目前针对卵巢癌的主要治疗方法为手术和化疗,当患者进行初始治疗时,手术效果是影响患者预后的重要因素,对于中晚期患者,初始满意的肿瘤细胞减灭术至关重要。除手术治疗外,系统化疗也是治疗卵巢癌的另一方法,通常选用铂类联合紫杉醇类药物。卵巢癌一线含铂化疗的有效率为70%,但通常半数以上的患者会复发。近些年,虽然卵巢癌的治疗进展不断更新,但对于复发性卵巢癌尚无统一的治疗方式。初始卵巢癌治疗以规范化为主,而复发性卵巢癌则以个体化治疗为主,主要的治疗方式包括二线化疗、再次肿瘤细胞减灭术、靶向治疗、内分泌治疗、放疗。卵巢癌的复发分为铂敏感复发和铂耐药复发两种,区分的标准为铂类药物停用的时间,停用6个月以上为铂敏感型复发,停药6个月之内复发为铂耐药复发。通常对于因铂耐药而复发的患者来说,指南推荐可选择非铂类化疗单药（紫杉类药物、吉西他滨、拓扑替康、依托泊苷）、靶向治疗（奥拉帕利）、或将非铂类化疗药物和贝伐单抗进行联合治疗。对于一线应用紫衫类药物联合铂方案化疗,二线多西他赛单药治疗的患者,有潜在耐药的可能。肿瘤多药耐药（multidrug resistance,MDR）作用的产生机制较为复杂。其中,得到广泛关注的有:①药物靶点突变;②药物摄入或流入减少;③激活代偿性细胞生存的信号通路;④增加DNA损伤修复方式;⑤使药物外排泵表达增加,从而减低耐药细胞药物的浓度等。P-糖蛋白（P-glycoprotein P-gp）是目前的研究热点,也称为ABC转运体B家族成员1（ATP-binding cassette subfamily B member 1,ABCB1）或多药耐药蛋白 1（multidrug resistance protein 1,MDR1）,此外多药耐药相关蛋白 2（Multidrug resistance-associated protein 1,MRP2）和乳腺癌耐药蛋白（Breast cancer resistance protein,BCRP,ABCG2）也是最常参与耐药化疗的超家族成员。生物界的转运蛋白多属于ABC家族。目前约100余种被发现,ABCB1的相对分子质量为170×103,是一种ATP依赖性膜蛋白,ABCB1除了癌细胞外,在上皮细胞顶端也是高水平表达,如结肠、肝胆管、胰腺小管、肾上腺、胎盘（血胎盘屏障）、睾丸（血睾丸屏障）、脑毛细血管（血脑屏障）。在解剖学上,ABCB1作为一个外排转运体,限制细胞摄取药物从血液进入大脑,并从肠腔进入肠细胞。另一方面,ABCB1分别促进肝细胞和肾上皮细胞的药物排泄进入胆汁和尿液。ABCB1的组成包括两同源核苷酸结合区域（nucleotide binding domain,NBD）和两个跨膜区域（transmembrane domain,TMD）。每个跨膜结构域由6个跨膜螺旋组成12个跨膜螺旋流出泵,结合疏水药物底物。它的亲水区域包含ATP结合位点,结合两个ATP分子。药物底物的流出导致ATP水解成ADP和无机磷酸盐,允许跨膜结构域结合另一个被流出的底物。通过这种连续循环的方式降低肿瘤细胞的耐药性。ABCB1的抗癌药物底物包括蒽环类、紫杉类、鬼叶藻毒素类、长春花生物碱类和酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）如拉帕替尼、厄洛替尼、舒尼替尼等。ABCB1的过表达与多种癌症相关,除实体瘤外还包括血液系统恶性肿瘤。逆转肿瘤耐药的方式有很多,针对ABCB1而言,主要如下:①化学逆转剂的应用;②改变临床用药在释放时的方式和系统;③与其他药物合用,提高药物有效性或降低药物毒性;④在基因水平进行逆转耐药;⑤应用纳米载体系统,快速高效的作用于肿瘤;⑥开发新型药物。ABCB1抑制剂处在不断的更新换代之中,已经历了三代发展,第一代抑制剂是在偶然的状况下发现的,包括维拉帕米、奎尼丁、胺碘酮等,在应用的过程中由于其对肾脏等器官具有一定的毒性作用而逐渐被第二代抑制剂所取代。第二代抑制剂的优点是在一定程度上增强了药物的活性,对肿瘤具有较好的治疗作用,临床中常用的主要有右旋维拉帕米、PSC833等,但是二代抑制剂对肝脏的解毒功能损伤严重,且长期应用会造成药物的代谢紊乱,危害机体的健康。第三代ABCB1抑制剂如dofequidar,zosuquidar,等,这些药物作用更强,药代动力学相互作用更少,但联合使用时会导致一些化疗毒性。虽然当前对于肿瘤抑制剂的研究很深入,但是仍没有MDR的逆转剂的相关报道应用于临床。靶向药物如TKIs在肿瘤治疗中起重要作用,但TKIs与传统抗癌药物少有协同作用。由于TKIs与传统抗癌药物主要毒副作用不重叠,同时,TKIs能与酪氨酸激酶的ATP结合点结合,从而抑制ABC转运泵的功能。研究发现阿法替尼、厄洛替尼、拉帕替尼等临床常用药物通过作用于其靶点蛋白ABCB1,抑制ABCB1的功能,从而增加MDR细胞内底物性抗癌药物的累积,以增加传统抗癌药物的体内外抗肿瘤效果。Apatinib（YN968D1）通常作用于血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2 VEGFR-2）,是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂,它会选择性的阻断信号传导,起到抗血管生成的作用,进而控制肿瘤发生。2014年12月,阿帕替尼被获批用于二线化疗失败的晚期胃癌患者。目前在肺癌、肝癌、食管癌、骨肉瘤等瘤种均开展了多项临床研究,尤其是探讨其与化疗、靶向、免疫治疗联合治疗的协同增效的相关临床研究取得了很好的结果。临床研究显示阿帕替尼在卵巢癌治疗中的疗效也是肯定的。综上所述,阿帕替尼治疗耐药性晚期实体瘤的相关研究逐步成为临床研究的热点。迄今为止,尚未有针对阿帕替尼协同多西他赛治疗卵巢癌的增效机制研究。本课题拟通过临床、体内、体外三个层面研究阿帕替尼对ABCB 1介导的卵巢癌多西他赛耐药的影响,深入探究阿帕替尼联合多西他赛治疗转移性卵巢癌的协同增效作用机制,为复发转移性卵巢癌患者提供新的治疗思路。第一部分阿帕替尼联合多西他赛对比单药多西他赛治疗转移复发性卵巢癌的疗效及安全性研究目的:探讨阿帕替尼联合多西他赛对照多西他赛治疗二线及以上铂耐药复发转移性卵巢癌的疗效及安全性。方法:临床上收集47例铂耐药复发转移性卵巢癌患者,根据治疗方案分为2组:单纯化疗组（24例）,阿帕替尼联合化疗组（23例）。具体给药方法:单纯化疗治疗组患者采取多西他赛单药化疗治疗,阿帕替尼联合化疗组采取多西他赛和阿帕替尼联合治疗,比较这两组卵巢癌患者的疗效和不良反应发生情况,监测多西他赛的血药浓度,研究分析这两组患者的血药浓度与疗效之间存在的关系。结果:1.阿帕替尼联合化疗组ORR及DCR均优于单纯化疗组。单纯化疗组CRO例,PR 4例,SD 7例,PD 31例,ORR为16.67%,DCR为45.83%;阿帕替尼联合化疗组CR0例,PR 11例,SD8例,PD 4例,ORR为47.83%,DCR 82.61%,两组ORR 比较有明显差异（P=0.022）,两组DCR 比较有明显差异（P=0.009）。2.阿帕替尼联合化疗组中位PFS均优于单纯化疗组。单纯化疗组中位PFS为3.2（1.8～5.1）个月,阿帕替尼联合化疗组中位PFS为8.8（7.5～10.1）个月,阿帕替尼联合化疗组PFS显著高于单纯化疗组,经log-rank检验,差异有统计学意义（χ2=17.22,P<0.01）。3.阿帕替尼联合化疗组中位OS均优于单纯化疗组。单纯化疗组中位OS为10（8.44～11.56）个月,阿帕替尼联合化疗组中位OS为16.7（14.84～18.56）个月,阿帕替尼联合化疗组生存时间较单纯化疗组时间长,经log-rank检验,两者有明显差异（χ2=44.35,P<0.01）。4.阿帕替尼联合化疗组常见不良反应为高血压、手足综合征、蛋白尿。与单纯化疗组相比,阿帕替尼联合化疗组常见不良反应为高血压（52.17%）、手足综合征（34.78%）、蛋白尿（30.43%）,有统计学意义,其余不良反应两组无明显差异。5.多西他赛的AUC与与疗效成正相关。单纯血药浓度-时间曲线下面积（area under the curve AUC）与疗效评价之间存在线性关系,χ2=6.224,P=0.013。Pearson相关结果显示,AUC与疗效评价有线性关系,AUC与疗效成正相关（R=-0.368,P=0.011）。结论:阿帕替尼联合多西他赛治疗铂耐药复发转移性卵巢癌,不论是近期疗效还是远期疗效均较单用化疗组有明显优势,且安全性较好,仅高血压、手足综合征、蛋白尼尿的发生率略高于单用化疗组。阿帕替尼联合多西他赛治疗效果显著,为临床广泛应用提供支持。第二部分阿帕替尼体内水平对ABCB 1介导的卵巢癌多西他赛化疗MDR的作用研究目的:构建耐药性荷瘤裸鼠动物模型,体内水平验证阿帕替尼协同耐药卵巢癌细胞对ABCB 1转运体底物性化疗药物多西他赛的抗肿瘤作用,初步探讨阿帕替尼与多西他赛联合治疗体内协同抑瘤作用机制,为提高卵巢癌治疗水平提供实验室依据。方法:1.构建卵巢癌耐药性BALB/c荷瘤裸鼠动物模型,a)对照组:腹腔注射生理盐水;b)多西他赛组:腹腔注射8 mg/kg多西他赛;c)阿帕替尼组:腹腔注射剂量100 mg/kg阿帕替尼;d)阿帕替尼联用多西他赛组:腹腔注射8 mg/kg多西他赛+100 mg/kg阿帕替尼。2.LC-MS/MS法检测组织及血浆中多西他赛的浓度。3.TUNEL实验检测组织细胞凋亡作用。4.Western blot测定P-gp水平变化。5.qRT-PCR检测组织中ABCB1转运体mRNA的表达。结果:1.阿帕替尼增效多西他赛对ES-2/D细胞异种移植肿瘤的生长抑制作用。各组小鼠初始体重差异无统计学意义（F=0.347,p=0.792）,组间均衡性良好。单纯使用多西他赛组的小鼠第20天小鼠体重均低于其他三组,差异均有统计学意义（P<0.01）。不同治疗组间的移植瘤体积存在明显差异性,对照组、阿帕替尼组、多西他赛组小鼠肿瘤体积显著增大（t=60.96,P<0.01;t=22.15,P<0.01;t=10.81,P<0.01）,而阿帕替尼联合多西他赛用药组小鼠肿瘤体积显著小于初始体积（t=7.45,P=0.001）。对照组的肿瘤抑制率是1.89%;阿帕替尼单独治疗组的肿瘤抑制率为82.00%;多西他赛治疗组的肿瘤抑制率为66.54%;而阿帕替尼联合多西他赛用药组小鼠的肿瘤抑制率为111.46%,联合治疗组小鼠的肿瘤抑制率高于单一治疗组（P<0.05）,差异具有统计学意义。2.阿帕替尼增高小鼠肿瘤组织多西他赛的浓度。多西他赛和阿帕替尼在肿瘤中的浓度差异有统计学意义（t=12.78,P<0.01）,在血浆、肾脏、肝脏、肺部及心脏中浓度差异无统计学意义（t=1.56,p=0.148;t=0.028,P=0.978;t=0.544,P=0.598;t=0.436,P=0.672;t=0.118,P=0.909）。3.阿帕替尼增效多西他赛诱导的ES-2/D细胞凋亡。TUNEL染色后,免疫荧光结果发现,与对照组、多西他赛组及阿帕替尼组相比,多西他赛和阿帕替尼联用会引起明显的细胞核碎裂,可见较多绿色荧光的TUNEL染色阳性细胞。4.阿帕替尼下调小鼠肿瘤组织ABCB1mRNA的表达。采用qRT-PCR检测四组小鼠肿瘤组织ABCB1mRNA的表达水平,对照组、阿帕替尼组、多西他赛组及多西他赛联用阿帕替尼组小鼠肿瘤组织ABCB1转运体mRNA的表达水平依次下降,单因素方差分析提示不同处理组表达水平差异显著（F=174.19,P<0.01）,Turkey检验两两比较,各处理组ABCB1转运体mRNA表达水平差异全部有统计学意义（P<0.01）。因此,多西他赛联合阿帕替尼给药组可显著降低肿瘤组织中ABCB1转运体在mRNA水平的表达量。5.多西他赛联合阿帕替尼降低了肿瘤中P糖蛋白的表达。qRT-PCR结果显示,给予多西他赛治疗后肿瘤组织中MDR1的基因表达水平显著升高（P<0.01）,药物治疗后肠道组织中的BCRP和MRP2的基因表达水平没有明显改变。Western blot结果显示,给予多西他赛治疗后肿瘤组织中P-gp表达水平显著升高（P<0.01）,阿帕替尼联合或不联合多西他赛对肠道组织MDR1、MRP2、BCRP的表达均无影响（P>0.05）。结论:1.本部分动物实验研究中,阿帕替尼提高多西他赛对卵巢癌肿瘤组织生长抑制作用。2.阿帕替尼与多西他赛对卵巢癌的体内协同抑瘤作用主要通过增加肿瘤局部多西他赛浓度、诱导肿瘤组织细胞凋亡、抑制肿瘤组织ABCB1基因及降低P-gp表达来实现。第三部分阿帕替尼体外水平对ABCB 1介导的卵巢癌多西他赛化疗MDR的影响及其作用机制研究目的:体外水平验证阿帕替尼对ABCB 1介导的卵巢癌多西他赛化疗MDR的影响及其作用机制。本部分主要通过细胞学实验,进一步探讨阿帕替尼联合多西他赛在耐药性卵巢癌中的治疗效果及其增效机制,为临床耐药性卵巢癌患者用药提供参考。方法:1.MTT法确定阿帕替尼用于体外实验时的浓度,MTT法检测细胞增值抑制率。2.细胞凋亡实验检测阿帕替尼对卵巢癌细胞凋亡的影响。3.药物蓄积实验检测罗丹明123在卵巢癌细胞中蓄积的影响。4.通过体外转运实验研究阿帕替尼对ABCB 1转运体外排过程的影响。5.Pgp-GloTM试剂盒检测阿帕替尼对ATPase的影响。6.Westeron blot检测阿帕替尼对耐药卵巢癌细胞中ABCB1转运体表达的影响。7.qRT-PCR检测不同浓度阿帕替尼、维拉帕米及拉帕替尼对MDR1表达的影响。8.Westeron blot检测NF-κB信号通路蛋白表达,免疫荧光法检测阿帕替尼对NF-κB的P65亚基的核转位的影响。结果:1.阿帕替尼细胞水平作用浓度预实验。阿帕替尼与化疗药物联用于卵巢癌敏感株ES-2细胞及卵巢癌耐药株ES-D细胞的三个浓度分别选为0.1、0.3、0.5μM及0.5、1.0、2.0μM。2.阿帕替尼可浓度依赖性地提高多西他赛对ES2/D细胞的抗肿瘤作用。敏感细胞株ES-2随着阿帕替尼联用浓度增加IC50的变化无统计学意义（F=2.75,P=0.112）;耐药细胞株ES-2/D随着阿帕替尼联用浓度增加IC50的降低,差异有统计学意义（F=12103,P<0.01）。3.阿帕替尼浓度依赖性的增加多西他赛诱导的ES-2/D细胞的凋亡作用。不同浓度条件下诱导ES-2/D细胞的凋亡率差异不显著(（F=0.081,P=0.968）。阿帕替尼和多西他赛对ES-2/D细胞凋亡率主效应均有统计学意义（F=509.40,P<0.01;F=717.92,P<0.01）,与阿帕替尼进行联用时,ES-2/D细胞的凋亡率表现出随着多西他赛浓度的增加,细胞凋亡率也在增加。不同浓度阿帕替尼联用多西他赛后凋亡率与单用相同浓度的多西他赛组相比,有显著差异（P<0.01）。4.阿帕替尼增加Rh123在ES-2/D细胞内的蓄积。ES-2细胞在不同浓度阿帕替尼实验组及维拉帕米阳性对照组中罗丹明123蓄积量差异无统计学意义（F=0.624,P=0.729）。阿帕替尼浓度与Rh123在ES-2/D细胞内的蓄积量成正比,阿帕替尼浓度越高,Rh123积蓄量越大（P<0.05）。5.阿帕替尼增强ABCB1转运体ATPase的活性。不同浓度阿帕替尼影响下,ABCB1转运体的ATPase的活性差异有显著差异（F=124.195,P<0.01）;不同浓度多西他赛影响下ABCB1转运体的ATPase的活性有显著差异（F=165.79,P<0.01）;与对照组相比,阿帕替尼与多西他赛均可增强ATPase的活性（P<0.05）。6.阿帕替尼降低ES-2/D细胞中MDR1基因mRNA的表达。ES-2/D细胞中ABCB1的表达水平显著高于ES-2细胞（P<0.05）,且阿帕替尼的浓度与ES-2/D细胞内ABCB1的表达水平成反比,阿帕替尼浓度越高,ABCB1表达水平越低。但是,ES-2/D细胞内ABCB1基因的表达不受维拉帕米和拉帕替尼的影响,差异不显著（P>0.05）。7.阿帕替尼降低ES-2/D细胞中ABCB1蛋白的表达。随着阿帕替尼浓度的逐渐升高,其对耐药ES-2/D细胞ABCB1转运体的抑制作用越大,细胞内ABCB1表达水平明显降低,在拉帕替尼作用的情况下,同等浓度的拉帕替尼对ABCB1转运体的表达水平无影响。8.阿帕替尼通过抑制NF-κB通路下调ABCB 1转运体的表达。检测阿帕替尼给药处理对ES-2/D细胞内NF-κB通路的影响,与NF-iκB通路的抑制剂PDTC作用相似,阿帕替尼显著下调了 ES-2/D细胞胞浆和胞核内NF-κB p65的表达水平。阿帕替尼会通过抑制NF-κ B信号通路的激活,进而降低ES-2/D细胞内ABCB1转运体的表达水平。结论:1.本部分研究证实阿帕替尼能够显著增强多西他赛在ES-2/D耐药细胞中的细胞毒性。2.阿帕替尼与多西他赛均可增强ATPase的活性,提示两者均为ABCB1的底物。3.阿帕替尼显著抑制了 ES-2/D耐药细胞内P-gp蛋白的表达量。4.阿帕替尼从mRNA水平与蛋白水平两个方面抑制了 ABCB1的表达。4.阿帕替尼会显著抑制NF-κB通路的激活,进而在蛋白水平上抑制ABCB1转运体的表达。