【摘 要】
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目的:通过检测长春花Chi细胞和CD细胞中生物碱含量差异和生物碱生物合成途径中几个已知基因的表达差异,初步探讨长春花Chi细胞生物碱超量合成的分子机制,并为进一步的研究建
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目的:通过检测长春花C<,20>hi细胞和C<,20>D细胞中生物碱含量差异和生物碱生物合成途径中几个已知基因的表达差异,初步探讨长春花C<,20>hi细胞生物碱超量合成的分子机制,并为进一步的研究建立差减cDNA文库.方法:细胞生长模式和生物碱含量差异的测定:细胞经液体培养基适应性培养之后,进行一为期16天的生长模式考察培养,每2天取一次样,培养完成后,将所有样本冷冻干燥,以干重计算生长量,确定生长模式.同时取冷冻干燥的细胞提取生物碱,HPLC检测各样本的生物碱含量,绘制检测周期内生物碱含量的变化曲线,并计算C<,20>hi和C<,20>D两种细胞中生物碱含量差异.已知基因在C<,20>hi细胞与C<,20>D细胞中表达差异的检测:两种细胞进行3个周期的同步化培养之后,收集细胞,提取总RNA,采用RT-PCR方法检测脱乙酰基文多灵4-O-乙酰转移酶基因(Dat)、色氨酸脱羧酶基因(Tdc)、裂环马钱子苷合成酶基因(Sls)、异胡豆苷合成酶基因(Str)、异胡豆苷β-葡萄糖苷酶基因(Sgd)等5个基因在C<,20>hi细胞和C<,20>D细胞中的表达量.差减cDNA文库的构建和初步筛选:以同步化培养细胞的总RNA为起始材料,采用抑制性差减杂交方法(SSH)建立差减cDNA文库,并用PCR方法进行初步筛选.结论:Str、Tdc、Sls、Sgd4个基因在C<,20>hi细胞中的表达高于在C<,20>D细胞中的表达,其中Str和Tdc在C<,20>hi细胞中的表达明显偏高,推测这几个基因表达的上调是C<,20>hi细胞超量合成生物碱的原因之一.
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