论文部分内容阅读
背景与目的:肾母细胞瘤(Wilmstumor:nephroblastoma,WT)是一种小儿肾脏恶性肿瘤,占小儿所有实体肿瘤的8%左右,是儿童最常见的实体肿瘤之一。Max Wilms1899年曾对该瘤的特征进行详细的描述,故又命名为Wilms’瘤。本病多见于7岁以内的儿童。本病的预后与肿瘤的组织学类型、发病年龄及是否转移等密切相关,但对其预后影响最大的是肿瘤的局部侵犯和向重要脏器的远处转移的情况。近40年来由于手术、化疗及放疗等措施的综合应用,肾母细胞瘤的死亡率大大降低,但是出现转移的患者预后仍然较差。利用分子生物学手段寻找与肿瘤侵袭和转移关系密切的基因,探索肿瘤预后标志物成为近年来医学界研究的热点。CXCR4是近年来分离出的肿瘤转移相关基因,已有研究证明该基因的过度表达与多种恶性肿瘤的侵袭和转移关系密切,而SDF-1作为其配体,二者的结合在肿瘤细胞的迁移、粘附、增殖、侵袭、抗凋亡、血管新生及转移中发挥重要作用。VEGF是作用最强的促血管生成因子之一,在肿瘤血管生成过程中发挥关键作用。VEGF表达在肿瘤的生长、浸润,转移和预后亦起着非常重要的作用。本研究运用RT-PCR技术检测肾母细胞瘤组织和瘤旁正常组织中的CXCR4mRNA的表达,并运用免疫组化技术检测CXCR4,SDF-1和VEGF蛋白的表达情况。分析三者与肾母细胞瘤临床病理指标的关系,并探讨三指标之间的相关性,旨在寻找可以准确预测和判断肿瘤预后的生物学指标,为肾母细胞瘤的临床治疗提供更多的实验依据。实验方法1.实验对象选择、组织样本的采集和患者临床资料的整理选取2007年-2008年间郑大三附院,郑大一附院,手术切除的肾母细胞瘤30例(其中新鲜标本19例蜡块11例)和瘤旁组织12例(距肿瘤大于5CM)分别为实验组和对照组,搜集患者的性别,临床分期,病理类型,有无淋巴结转移等方面的临床资料,便于统计分析和研究。2.采用Trizol试剂提取肾母细胞瘤组织RNA。通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳及RNA的OD值评估RNA的含量和纯度。3.使用Promega公司的AMV逆转录试剂盒进行cDNA的逆转录。RT-PCR扩增β-actin的检测逆转录效果。4.设计两者引物,对CXCR4基因在肾母细胞瘤及瘤旁正常组织中表达量进行检测,CXCR4的相对含量=(CXCR4密度/β-actin密度)。5.免疫组化方法检测CXCR4、SDF-1和VEGF三种蛋白的表达情况。阳性细胞胞质着色,按染色强度分别进行计分。计算机辅助图像分析求其光密度(OD)值平均值,代表其蛋白的含量。6.统计学分析运用SPSS15.0统计软件,采用χ~2检验,Fisher精确检验和独立样本t检验等方法对实验数据进行统计学处理。以P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果1.RT-PCR结果显示肿瘤组织中CXCR4mRNA的相对含量高于瘤旁组织(P＜0.05)。CXCR4mRNA相对含量在淋巴结转组高于无淋巴结转移组,临床分期Ⅲ-Ⅳ组高于Ⅰ-Ⅱ期组,预后不良组CXCR4mRNA相对含量高于预后良好组。免疫组化检测CXCR4蛋白结果和PCR结果吻合,呈现一致的变化趋势。2.肾母细胞瘤中SDF-1蛋白阳性表达率是53.3%(16/30),高于瘤旁肾组织(P＜0.05)。SDF-1蛋白光密度值在淋巴结转组高于无淋巴结转移组,临床分期Ⅲ-Ⅳ组显著高于Ⅰ-Ⅱ期组,预后不良组高于预后良好组(P＜0.05)。3.肾母细胞瘤中VEGF蛋白阳性表达率是63.3%(19/30),高于瘤旁组织(P＜0.05)。VEGF蛋白光密度值在淋巴结转组高于无淋巴结转移组,临床分期Ⅲ-Ⅳ组高于Ⅰ-Ⅱ期组,预后不良组高于预后良好组(P＜0.05)。4.相关性分析CXCR4与VEGF、SDF-1呈正相关(r=0.439,0.427 P＜0.05),SDF-1与VEGF呈正相关(r=0.369 P＜0.05)。结论1.RT-PCR技术与免疫组化技术检测肾母细胞瘤组织CXCR4在mRNA和蛋白的表达水平,结果表明其转录水平和翻译水平具有一致性。2.肾母细胞瘤中CXCR4、SDF-1和VEGF表达较对照组增高,并与NTWS分期、病理分型和淋巴结转移相关。3.CXCR4、SDF-1和VEGF表达有相关性,CXCR4、VEGF和SDF-1的高表达提示肿瘤具有更高的侵袭转移能力。4.对肾母细胞瘤中CXCR4、VEGF和SDF-1的表达进行检测,可以判断其恶性行为,预测浸润和转移的潜能,为临床治疗提供理论依据。