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发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS),是一种新发出血热性传染病,由一种新的布尼亚病毒,简称SFTSV引起。SFTS每年的发病率大约是每10万农村人口中有5人发病,主要感染中老年人,病死率平均是12%。自2009年在中国发现以来,SFTSV已在韩国和日本报道,相似病毒在美国报道。SFTSV是布尼亚病毒科白蛉病毒属的单股负链RNA病毒,包含L、M、S三个片段,分别编码RNA聚合酶、糖蛋白(Gn、Gc)前体、核蛋白NP和非结构蛋白NSs。其中Gn、Gc最可能诱导中和抗体的产生,目前已有研究发现能结合M片段的单克隆抗体(MAb4-5)可以中和SFTSV;而S片段最为保守,NP最易表达,常被用来做免疫检测用。本研究旨在构建NP、Gn、Gc及M片段分段蛋白的真核表达载体,表达相应蛋白,从抗原性和免疫原性方面检测NP的生物学活性,为进一步研究中和抗体做好铺垫。目的1、构建核蛋白NP,糖蛋白Gn、Gc真核表达载体。2、构建M片段(编码糖蛋白)分段真核表达载体。3、表达核蛋白,研究重组核蛋白NP的生物学活性。方法1、设计引物扩增NP、Gn和Gc。2、设计引物分20段扩增M片段(M1-M20),每段重叠30个碱基。3、设计引物分别扩增NP、Gn和M1,建立与GFP的融合蛋白序列,监测蛋白表达情况。3、将目的基因与克隆载体19T(Simple)连接扩增后,再与表达载体pVAX1连接。4、将目的基因-pVAX1构建的表达载体用阳性脂质体法转染至Vero细胞,在Vero细胞内表达,用Western blot、间接免疫荧光、显微镜观察融合蛋白荧光的方法检测蛋白表达,用镍柱纯化带His标签的NP。5、包被纯化的NP,包被板与商品化试剂盒同时检测羊血清中SFTSV抗体,比较检测的效果。6、用纯化的NP免疫BALB/c小鼠,测定血清滴度。结果1、构建出核蛋白NP,糖蛋白Gn、Gc, M片段分段蛋白的真核表达载体,构建出NP、Gn、Gc、M1分别和GFP的融合蛋白表达载体,测序正确。检测到上述蛋白在Vero细胞中的表达。2、用NP自行包被的包被板与商品化的试剂盒在检测羊血清阳性率的效果上,没有统计学差异。3、用NP免疫BALB/c小鼠获得有效阳性血清。结论1、构建的pVAX1真核表达载体,转染Vero细胞后可表达NP、Gn、Gc及M片段的分段蛋白,但M片段编码的蛋白表达量较低。2、用pVAX1构建的表达载体在Vero细胞中表达出的NP在ELISA和免疫动物方面具有良好的生物学活性。