结直肠癌(CRC)是世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一,据估计每年新发病例为180万,并有88万人死于结直肠癌。5-氟尿嘧啶(5-FU)和奥沙利铂(L-OHP)是用于结直肠癌治疗的一线化疗药物。化疗耐药已成为肿瘤治疗的最大障碍,严重限制化疗药物的临床应用。天然产物由于具有结构多样性、副作用小等优点,是筛选和开发拥有抗癌活性化合物的宝贵来源。因此从天然产物中寻找提高化疗敏感性的活性小分子,是克服化疗耐药的一个重要的途径。葫芦素E(Cucurbitacin E)是一类具有多种生物活性的天然高度氧化的四环三萜类化合物,主要存在于黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜等葫芦科植物中,在十字花科等高等植物及一些大型真菌中也有发现。目前,葫芦素E已被证实具有免疫调节、抑制炎症反应、肝脏保护、抗糖尿病和抗肿瘤作用。最新研究表明,葫芦素B不仅可以诱导癌细胞凋亡抑制肿瘤生长,并且具有逆转肿瘤耐药的作用。然而葫芦素家族的重要成员葫芦素E在调控结直肠癌化疗耐药中的作用仍不清楚。本课题通过葫芦素E与化疗药物联合使用探讨葫芦素E在调控结直肠癌细胞化疗药物敏感性中的作用,同时利用磁性纳米材料鉴定葫芦素E的胞内直接作用靶蛋白,并深入研究葫芦素E诱导结直肠癌细胞衰老促进抗癌效果的分子机制。本课题的研究内容包括以下三部分:1.采用MTT实验发现葫芦素E联合化疗药物抑制结直肠癌细胞活力;通过细胞克隆形成实验检测葫芦素E联合化疗药物对结直肠癌细胞克隆形成的抑制作用;Annexin V/PI染色流式细胞术结果表明葫芦素E与化疗药物联合处理可以促进L-OHP诱导的结直肠癌细胞凋亡;利用高效液相色谱法检测葫芦素E对罗丹明胞内累积的影响,发现葫芦素E可明显抑制结直肠癌细胞的药物外排功能;qPCR和Western blot的结果进一步表明,葫芦素E可以降低化疗耐药蛋白ABCC1、MDR1的mRNA水平和蛋白水平。这些结果说明,葫芦素E通过抑制ABCC1与MDR1的表达,从而促进结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性。2.利用合成的偶联有葫芦素E的磁性纳米材料,进行Solid-phase固相垂钓实验,并对葫芦素E在细胞内的结合蛋白进行蛋白质组学分析。基因本体论(Gene Ontology)结果发现葫芦素E的胞内结合蛋白在Wnt/β-catenin信号通路上有所富集。Western blot、qPCR以及免疫荧光染色实验的结果表明,葫芦素E与5-FU联用可以明显降低β-catenin的表达水平。在结直肠癌细胞中对β-catenin进行敲低或过表达处理,结果发现β-catenin过表达后可以抑制CE引起的化疗增敏,而敲低β-catenin能够促进葫芦素E诱导的化疗敏感性。此外,MTT、免疫荧光染色、Western blot以及流式凋亡结果,进一步表明葫芦素E可促进化疗药物对耐药细胞的杀伤作用。转录因子激活增强子结合蛋白4(TFAP4)是葫芦素E的胞内结合蛋白之一,葫芦素E与5-FU联用可以显著降低TFAP4的表达。过表达TFAP4逆转了由葫芦素E和5-FU联合处理引起的β-catenin、ABCC1和MDR1蛋白的下调,进而明显降低葫芦素E诱导结直肠癌细胞对5-FU的化疗敏感性。因此,葫芦素E通过抑制TFAP4/Wnt/β-catenin信号促进结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性。3.MTT、细胞克隆形成以及EdU实验等结果表明,高剂量葫芦素E能够显著抑制结直肠癌细胞HCT-116和DLD1的增殖。台盼蓝染色结果显示,低剂量的葫芦素E对结直肠癌细胞增殖并无影响。低剂量的葫芦素E可促进β-半乳糖苷酶活性增强,诱导结直肠癌细胞衰老。葫芦素E的处理可明显抑制TFAP4、pRb及Cyclin D1的表达,并促进p16、p21、p53等衰老相关基因的表达。葫芦素E引起的结直肠癌细胞衰老可被过表达TFAP4所逆转。进一步研究发现,与对照细胞相比,由葫芦素E诱导衰老的结直肠癌细胞可被白藜芦醇选择性清除。此外,葫芦素E处理不会引起正常肝细胞HL-7702发生衰老,同时白藜芦醇对葫芦素E处理过的HL-7702的细胞增殖无影响。综上所述,葫芦素E通过抑制TFAP4/Wnt/β-catenin信号通路增强结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性;同时葫芦素E通过靶向抑制TFAP4的表达,上调衰老相关基因进而选择性诱发结直肠癌细胞的衰老,并且白藜芦醇可以特异地杀死衰老的结直肠癌细胞,促进结直肠癌的抗肿瘤效果。本研究结果揭示葫芦素E在结直肠癌化疗增敏方面具有一定的应用潜力,也为结直肠癌治疗提供新策略和新思路。