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目的:弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一组具有明显异质性的侵袭性B细胞淋巴瘤,是非霍奇金淋巴瘤中最常见的亚型,约占3540%,主要分为生发中心型（GCB）和非生发中心型两大类。其中,GCB-DLBCL被认为起源于生发中心母细胞,且发病机制复杂。尽管基因异常是GCB-DLBCL发生发展的重要起始因素,但是表观遗传学改变在疾病进程中的作用也受到越来越多的关注。长链非编码RNA（lncRNA）是近年来的研究热点,其异常表达与包括肿瘤在内的很多疾病密切相关,但是lncRNA在GCB-DLBCL中的作用及机制尚不明确。本课题将重点研究GCB-DLBCL的lncRNA表达谱,并选择其中差异倍数较高的lncRNA进行细胞生物学功能研究,并对其可能的作用机制进行初步探索。方法:第一部分:生发中心型弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系和正常CD19+B细胞中长链非编码RNA的芯片检测和生物信息学分析1.CD19免疫磁珠分离的健康人外周血白细胞中的CD19+B细胞作为对照组,应用lncRNA/mRNA芯片筛选人GCB-DLBCL细胞系OCI-Ly1和OCI-Ly19中差异表达的lncRNA/mRNA。2.收集标本,包括10例GCB-DLBCL组织样本及10例淋巴结反应性增生（RLN）组织样本。应用qRT-PCR检测NR026892（AFAP1-AS1）、ENST00000455011、ENST00000451368、ENST00000464929、ENST00000475089、ENST00000558952、ENST00000425358、ENST00000424690在OCI-Ly1和OCI-Ly19细胞系中的表达水平,验证其表达趋势是否与芯片结果一致,并在10例GCB-DLBCL组织样本和10例RLN组织样本中应用qRT-PCR技术检测上述与芯片结果一致的lncRNA的表达水平,进一步验证。3.以经qRT-PCR验证的lncRNA为中心,结合mRNA表达谱构建lncRNA-mRNA共表达网络,通过生物信息学分析对差异表达的lncRNA进行功能预测。第二部分:沉默GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤细胞中AFAP1-AS1的表达对细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响1.本课题选择AFAP1-AS1进行进一步研究。制备和包装能够沉默AFAP1-AS1表达的腺病毒,感染对数生长期的GCB-DLBCL细胞系OCI-Ly1和OCI-Ly19,建立沉默AFAP1-AS1表达的GCB-DLBCL细胞系。2.设立三组:实验组（sh-AFAP1-AS1干扰序列腺病毒感染细胞组）、无关序列对照组（sh-NC无关序列腺病毒感染细胞组）和空白组（未感染腺病毒细胞组）。3.CCK-8法检测三组细胞的增殖能力。4.流式细胞术（Annexin V/7-AAD）检测三组细胞的凋亡率。5.流式细胞术（PI）检测三组细胞的周期进程。6.Western-blot检测三组细胞中凋亡和周期相关蛋白的表达情况。第三部分:AFAP1-AS1在GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤细胞中作用机制研究1.设立两组:实验组（sh-AFAP1-AS1干扰序列腺病毒感染细胞组）、无关序列对照组（sh-NC无关序列腺病毒感染细胞组）。2.应用Label-free蛋白质谱技术检测两组细胞的差异表达蛋白。3.对差异表达蛋白进行KEGG Pathway分析,由此确定AFAP1-AS1下游分子富集的信号通路。4.通过生物信息学预测与AFAP1-AS1及其下游分子均能互补结合的microRNA。5.构建报告基因载体H-AFAP1-AS1-WT/H-AFAP1-AS1-MUT和H-BTK-3’UTR-WT/H-BTK-3’UTR-MUT,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-670-3p与BTK和AFAP1-AS1均可互补结合,并能够负性调控二者表达。结果:第一部分:生发中心型弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系和正常CD19+B细胞中长链非编码RNA的芯片检测和生物信息学分析1.LncRNA芯片技术筛选出分别有1,648个lncRNA转录本和2,671个lncRNA转录本在GCB-DLBCL细胞系（OCI-Ly1和OCI-Ly19）中表达上调和下调（Fold Change≥2.0,P-value<0.05）。2.qRT-PCR检测结果显示ENST00000424690、ENST00000425358、NR026892（AFAP1-AS1）在OCI-Ly1和OCI-Ly19细胞系以及10例GCB-DLBCL组织样本中表达上调,而ENST00000464929和ENST00000475089的表达水平下调（Fold Chang≥2.0,P<0.05）。芯片结果和qRT-PCR结果基本保持一致,验证了芯片结果的可靠性。3.LncRNA-mRNA共表达网络图表明:3个细胞周期相关基因（GTSE1、CDK4、CDK1）和4个泛素-蛋白酶体相关基因（PSMA7、PSMD14、UBE2K、UBE2C）与ENST00000464929和ENST00000475089的表达呈负相关;ENST00000425358和NR026892（AFAP1-AS1）与某些原癌或抑癌基因（MYB、RABL3、XAF1）的表达显著相关。第二部分:沉默GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤细胞中AFAP1-AS1的表达对细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响1.成功制备三种sh-AFAP1-AS1干扰序列腺病毒和sh-NC无关序列腺病毒,腺病毒AFAP1-AS1 shRNA13的滴度均为1.58×10100 PFU/ml。对比空白组和无关序列对照组,感染AFAP1-AS1 shRNA13腺病毒的细胞中AFAP1-AS1的表达水平显著下调（P<0.05）。2.CCK8法检测结果表明OCI-Ly1和OCI-Ly19细胞中,sh-AFAP1-AS1组细胞较空白组和无关序列对照组吸光度值显著减少,且随着时间的持续,差异越来越大。3.流式细胞术（Annexin V/7-AAD）检测结果表明OCI-Ly1和OCI-Ly19细胞中,sh-AFAP1-AS1组细胞的早期和晚期凋亡率较空白组和无关序列对照组显著升高,有统计学差异（P<0.05）。4.流式细胞术（PI）检测结果表明OCI-Ly1和OCI-Ly19细胞中,sh-AFAP1-AS1组细胞的G0/G1期细胞比例较空白组和无关序列对照组显著升高,S期细胞比例显著减少,有统计学差异（P<0.05）。5.Western blot检测结果表明OCI-Ly1和OCI-Ly19细胞中,sh-AFAP1-AS1组细胞与空白组和无关序列对照组相比,Cleaved Caspase-3和凋亡促进蛋白Bax的表达上调,而细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E和凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达下调,有统计学差异（P<0.05）。第三部分:AFAP1-AS1在GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤细胞中作用机制研究1.沉默OCI-Ly1细胞中AFAP1-AS1后,蛋白质谱结果表明有122个蛋白表达上调,有124个蛋白表达下调,其中有4个DLBCL驱动基因POU2F2、BTK、PTPN6和XPO1的蛋白表达水平随AFAP1-AS1沉默而发生下调。2.通过对蛋白质谱结果中的差异蛋白进行KEGG Pathway分析,发现差异蛋白富集在泛素-蛋白酶体途径、B细胞受体通路（BCR）、TNF通路等多种肿瘤相关通路。3.Western blot检测结果表明OCI-Ly1和OCI-Ly19细胞中,sh-AFAP1-AS1组与无关序列对照组细胞相比,BCR通路的关键激酶——BTK激酶及其磷酸化形式的表达水平减低,与质谱结果一致（P<0.05）。4.生物信息学预测出AFAP1-AS1、BTK与miR-670-3p互补结合及其结合位点。5.双荧光素酶报告基因实验证实miR-670-3p能够分别与AFAP1-AS1和BTK互补结合,并下调二者的表达。结论:1.与正常CD19+B细胞相比,OCI-Ly1和OCI-Ly19细胞系中有1,648个lncRNA转录本表达上调,有2,671个lncRNA转录本表达下调,AFAP1-AS1是其中差异倍数较高的lncRNA之一。2.沉默AFAP1-AS1可通过影响细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax以及细胞周期相关蛋白Cyclin D1和Cyclin E1的表达水平来抑制GCB-DLBCL细胞增殖、促进细胞凋亡,以及使细胞周期阻滞于G0/G1期。3.沉默AFAP1-AS1后差异蛋白富集在多种肿瘤相关通路,包括泛素-蛋白酶体途径、BCR信号通路和TNF信号通路。4.GCB-DLBCL中过度表达的AFAP1-AS1可能通过与BCR通路关键激酶BTK竞争性结合miR-670-3p,从而使miR-670-3p对BTK的负性调节作用减弱,导致BTK表达上调而发挥促癌作用。